临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子与ISCR1研究

吴奎海，伍启康，李炜煊

(佛山市第一人民医院检验科，广东 佛山 528000)

临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子与ISCR1研究

吴奎海，伍启康，李炜煊

(佛山市第一人民医院检验科，广东 佛山 528000)

目的 了解临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌和铜绿假单保菌Ⅰ类整合子与插入序列共同区1 (ISCR1)的分布情况。方法2010年1月至2013年12月共收集我院126株多重耐药鲍曼不动杆菌和89株多重耐药铜绿假单胞菌，采用PCR法扩增Ⅰ类整合酶、Ⅰ类整合子基因盒、ISCR1、ISCR1可变区。Ⅰ类整合基因盒和ISCR1可变区的PCR产物分别用HinfⅠ、RasⅠ进行酶切，相同类型酶切图谱的PCR产物随机挑取一例进行测序，测序结果在GenBank中用BlastN进行核酸序列同源性搜索。结果在多重耐药鲍曼不动杆菌中，检出79例Ⅰ类整合酶，67例Ⅰ类整合子基因盒阳性，含有6种类型；59例ISCR1阳性，其中9例ISCR1可变区阳性。在89株多重耐药铜绿中，检出41例Ⅰ类整合酶，36例Ⅰ类整合子基因盒阳性，含有10种类型；9例ISCR1阳性，其中4例ISCR1可变区阳性。有8株鲍曼不动杆菌和2株铜绿假单胞菌同时携带Ⅰ类整合子和ISCR1可变区结构。结论在多重耐药铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中，Ⅰ类整合子和ISCR1分布较广。

多重耐药；鲍曼不动杆菌；铜绿假单胞菌；整合子；ISCR1

近年来随着抗生素的滥用，多重耐药鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的耐药给临床治疗带来严重挑战，整合子和插入序列共同区在耐药基因的水平转移中发挥重要作用。Ⅰ类整合子在临床上最常见，与多种耐药基因相关，可以捕获和表达多种耐药基因[1]。插入序列共同区1(insertion sequence common region 1，ISCR1)是一种类似IS-91的转座元件，以滚环形式转座邻近的耐药基因，有不同类型的耐药基因可变区(variable region)[2]。本文主要对临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的Ⅰ类整合子和ISCR1结构进行研究。

1 材料与方法

1.1 临床菌株 留取南方医科大学南方医院和佛山市第一人民医院微生物室2010年1月至2013年12月微生物室分离的126株多重耐药菌鲍曼不动杆菌和89株多重铜绿假单胞菌。多重耐药菌定义为对下列五类抗菌药物中至少三类抗菌药物耐药的菌株[3-4]：头孢菌素、碳青霉烯类抗生素、含有β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂、氟喹诺酮类抗菌药物、氨基糖苷类抗生素。Vitek2-compact进行菌株属种鉴定和药敏试验，根据CLSI 2015的标准判断结果。质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC25922。同一患者只取第一次分离株，纸片法-80℃冻存。

1.2 主要仪器和试剂 PCR扩增仪器为德国Eppendorf公司，凝胶成像仪为Bio-Rad公司，TaqDNA聚合酶、HinfⅠ和RasⅠ限制性内切酶购自TaKaRa公司。

1.3 PCR反应体系 Ⅰ类整合酶、Ⅰ类整合子基因盒、ISCR1、ISCR1可变区引物序列参考文献[2，5]，具体见表1。细菌DNA提取采用TaKaRa公司试剂盒(Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR)，于-20℃保存。PCR反应体系为20 μL，DNA模板1 μL，TaqDNA聚合酶1 U，含Mg2+的10×buffer 2 μL，dNTP终浓度为200 μmol/L，上下游引物终浓度均为0.2 μmol/L，加入灭菌去离子水至20 μL。

表1 PCR反应引物序列

1.4 Ⅰ类整合子基因盒和ISCR1可变区酶切及序列分析 对Ⅰ类整合子基因盒和ISCR1可变区的PCR产物分别用HinfⅠ和RasⅠ进行酶切，初步判断是否携带相同的耐药基因。HinfⅠ和RasⅠ反应体系为：PCR产物5 μL，10×H Buffer 2 μL，Hinf I(10 U/μL)或RasⅠ(10 U/μL)0.5 μL，加入灭菌去离子水至20 μL，酶切产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳。不同类型酶切图谱的PCR产物随机挑取一例，送去华大基因科技公司测序，测序结果在GenBank数据库中用BlastN进行比对。

2 结 果

2.1 Ⅰ类整合酶与Ⅰ类整合子基因盒检测 126株多重耐药鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合酶阳性率为62.7% (79/126)，89株多重耐药铜绿假单菌Ⅰ类整合酶阳性率为46.1%(41/89)。对Ⅰ整合酶阳性菌株进一步检测Ⅰ类整合子基因盒类型，鲍曼不动杆菌阳性率为53.2%(67/126)，铜绿假单菌阳性率为40.4%(36/89)。Ⅰ类整合酶阳性菌PCR扩增电泳见图1。

2.2 ISCR1及可变区检测 126株多重耐药鲍曼不动杆菌ISCR1阳性率为46.8%(59/126)，89株多重耐药铜绿假单菌ISCR1阳性率为16.9%(15/89)。对ISCR1阳性菌株进一步检测ISCR1可变区，鲍曼不动杆菌阳性率为15.3%(9/59)，铜绿假单菌阳性率为4.5%(4/89)。ISCR1阳性菌PCR扩增电泳图见图2。

图1 Ⅰ类整合酶电泳结果

图2 ISCR1电泳结果

2.3 Ⅰ类整合子基因盒结构 67株Ⅰ类整合子阳性鲍曼不动杆菌株，经酶切分析共含有6种基因盒；36株Ⅰ类整合子阳性铜绿假单胞菌，经酶切分析共含有10种基因盒，具体的基因盒测序结果见表2。

表2 103株多重耐药非发酵菌Ⅰ类整合子基因盒种类

2.4 ISCR1可变区结构 在9株鲍曼不动杆菌ISCR1可变区阳性菌株中，5株含有qnrA1+ampR，4株含有blaPER-1+GST+ABC transporter；4株铜绿假单胞菌ISCR1可变区阳性菌株中均含有qnrA1+ampR。

2.5 Ⅰ类整合子和ISCR1共存 有8株鲍曼不动杆菌和2株铜绿假单胞菌均含有Ⅰ类整合子和ISCR可变区，耐药基因组合模式，见表3。

表3 Ⅰ类整合子和ISCR1共存携带的耐药基因种类

3 讨 论

Ⅰ类整合子是介导革兰阴性杆菌的多重耐药的重要原因之一，在本研究中多重耐药鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合酶阳性率为62.7%，低于黄帆等[6]报道的78.4%；多重耐药铜绿假单胞菌的Ⅰ类整合酶阳性率为46.1%，低于肖晓光等[7]报道的56.1%。多重耐药鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的Ⅰ类整合子基因盒种类有所不同，但有的同一基因盒在两者均有分布，甚至有的单个耐药基因可以和不同的耐药基因形成组合，这些都反映了整合子能对基因盒进行捕获和剪切使其发生移动。在鲍曼不动杆菌的6种Ⅰ类整合子基因盒类型菌株中，氨基糖苷类乙酰转移酶的基因有aacA4、aacC1，编码氨基糖苷类核苷转移酶基因有aadA1、aadB、aadA2。catB8、catB3编码氯霉素乙酰转移酶介导酶灭活机制，乙酰化后的氯霉素不能与核糖体结合从而形成耐药，dfrA15编码二氢叶酸还原酶，对甲氧苄啶耐药。arr-3编码利福平ADP-核糖基转移酶，导致对利福平耐药。aacA4+catB8+aadA1最为常见，与国内外文献报道一致，但不同地区耐药基因盒种类有所差异，Chen等[8]对华东地区多重鲍曼不动杆菌研究显示，aacA4+catB8+aadA1和dfrXII+orfF+ aadA2比率分别为84.3%、15.6%。台湾地区报道的基因盒常见组合模式为aacA4+catB8+aadA1、aacC1+ orfX+orfX+orfX'+aadA1a、dfrXII+orfF+aadA2[9]。在欧洲国家流行的基因盒模式为aacA4+catB8+aadA1、aacA4、aacC1+orfX+orfX'+aadA1a、aacC1+orfX+orfX+ orfX'+aadA1a[10]。

Ⅰ类整合子与铜绿假单胞菌对头孢类、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类、氨基糖苷类和喹诺酮类抗菌药物的耐药有关，氨基糖类耐药基因检出aacA4、aac (6')-II、aadA2、aadA13、aadB等五种，cmlA8属于特异性外排系统，通过主动泵出氯霉素使其在菌体内的含量明显减少。在36株I类整合子阳性株中，blaIMP-9+ aacA4+blaOXA-10+aadA2最常见，占了44.4%(16/ 36)。黄小荣等[11]报道常见基因盒模式为blaPSE-1+ aadB、aac(6')-II+aadA13+cmlA8+blaOXA-10，在非洲地区流行aadA6+orfD、aadA13[12]。52.8%(19/36)的基因盒含有blaIMP-9，编码金属β-内酰胺酶基因，能水解碳青霉烯酶类抗生素。Xiong等[13]报道中国广州地区耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌携带的blaIMP-9基因，位于大约450 kb的TncP-2接合性质粒上可引起院内基因水平传播。有69.4%(25/36)的Ⅰ类整合子含有D类β-内酰胺酶基因OXA-10、OXA-30，但未发现能水解碳青霉烯的OXA型酶。

在ISCR1结构研究中发现74株ISCR1阳性仅13株可变区扩增阳性，可能是ISCR1携带的耐药基因下游不含有典型的3'-CS结构或片段过大，导致PCR扩增失败，也可能是不含有任何耐药基因。ISCR1大都与qnr相关，qnr属于质粒介导的喹诺酮类耐药基因，通常与ESBL、氨基糖苷类基因和AmpC酶共存。在此qnrA1都与amp相连，amp是对qnrA1的转录起调节作用，在9株菌均发现此耐药基因组合模式。qnrA1+ ampR也在肠杆菌科细菌中发现，表明ISCR1携带qnrA1在不同属种细菌之间水平转移。此耐药4株鲍曼不动杆菌的ISCR1可变区含有三个阅读框PER-1+ GST+ABC组合模式，PER-1是ESBLs的一种，能水解头孢噻肟、头孢他啶、氨曲南，但对碳青霉烯类、头霉素等敏感，它的遗传环境与Tn1213有关[14]。GST的功能是谷胱甘肽硫化转移酶，ABC编码一个转运体基因[2]。本研究结果发现76.9%(10/13)多重耐药非发酵菌株同时携带Ⅰ类整合子和ISCR1，可能形成复杂性Ⅰ类整合子[15]，加快了多重耐药性的水平传播。

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Study on classⅠ integron and ISCR1 in clinical isolates of multidrug-resistant Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa.

WU Kui-hai,WU Qi-kang,LI Wei-xuan.Department of Clinical Laboratory,the First People’s Hospital of Foshan,Foshan 528000,GuangDong,CHINA

ObjectiveTo investigate the distribution situation of classⅠ integron and insertion sequence common region 1(ISCR1)in clinical isolates of multidrug-resistant Acinetobacter baumanii and Pseudomonas aeruginosa.MethodsA total of 126 strains of multidrug-resistant Acinetobacter baumanii and 89 strains of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa in our hospital between January 2010 and December 2013 were collected.ClassⅠintegrase, classⅠintegron gene cassette,ISCR1 and variable region of ISCR1 were amplified by PCR.PCR products of classⅠintegron and variable region of ISCR1 were digested with HinfⅠand RasⅠ,respectively.PCR products of different types of the restriction map were selected,sequenced,and then aligned with GenBank database using BlastN program.ResultsIn 126 cases of multidrug-resistant Acinetobacter baumanii,there were classⅠintegrase in 79 cases,classⅠintegron gene cassette in 67 cases,which contained 6 different types.ISCR1s were detected positive in 59 cases,of which variable region of ISCR1 was positive in 9 cases.In 89 cases of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa, there were classⅠintegrase in 41 cases,classⅠintegron gene cassette in 36 cases,which contained 10 different types. ISCR1 positive showed in 9 cases,of which variable region of ISCR1 was positive in 4 cases.Eight strains of Acinetobacter baumanii and two strains of Pseudomonas aeruginosa contained classⅠintegrase and variable region of ISCR1, simultaneously.ConclusionClassⅠintegron and ISCR1 are widespread in multidrug-resistant Acinetobacter baumanii and Pseudomonas aeruginosa.

Multidrug-resistant;Acinetobacter baumanii;Pseudomonas aeruginosa;Integron;Insertion sequence common region 1(ISCR1)

R378

A

1003-6350（2017)04-0594-04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.04.025

2016-08-21)

吴奎海。E-mail：wukuihai2000@163.com