ERα、ERβ和EGFR在人肺癌组织芯片中的表达和意义

陈素琴，袁海洪

(武清区人民医院病理科，天津 301700)

ERα、ERβ和EGFR在人肺癌组织芯片中的表达和意义

陈素琴，袁海洪

(武清区人民医院病理科，天津 301700)

目的 探讨雌激素受体α(ERα)和β(ERβ)及表皮生长因子受体(EGFR)在肺癌患者肿瘤组织中的表达及意义。方法选取癌前病变组(不典型腺瘤样增生)12例，原发肺癌组77例，淋巴结转移性肺癌组12例构建成进展组织芯片。应用免疫组化方法检测ERα、ERβ和EGFR在此芯片中的表达，并探讨其相互关系。结果在进展组织芯片癌前病变组、原发肺癌组及淋巴结转移性肺癌组中ERα的表达阳性率分别为91.67%、62.34%和25.00%，不同组间比较差异有统计学意义(P＜0.01)；ERβ的表达阳性率分别为91.67%、55.84%和16.67%，不同组间比较差异有统计学意义(P＜0.01)；EGFR的表达阳性率分别为25.00%、59.74%和91.67%，不同组间比较差异有统计学意义(P＜0.01)。在原发肺癌中，ERα表达与性别、组织学分型、肿瘤分化程度及P-TNM分期有关(P＜0.05)，ERβ表达与性别、组织学分型、肿瘤分化程度、P-TNM分期及淋巴结转移有关(P＜0.05)，EGFR表达与淋巴结转移及肿瘤的P-TNM分期有关(P＜0.05)。ERβ和EGFR的表达呈正相关(r=0.612，P＜0.01)。结论ERα、ERβ及EGFR均与肺癌的发生发展有关，且ERβ和EGFR的表达相关，这种潜在的机制及关联性为将来的进一步研究提供了基础。

组织芯片；免疫组织化学；肺癌；雌激素受体α；雌激素受体β；表皮生长因子受体

雌激素在多种肿瘤中的促癌作用已经得到证实。雌激素受体(ER)的表达与肺癌的发生发展密切相关。表皮生长因子受体(EGFR)属于酪氨酸激酶家族，在多种癌症中有过表达，包括肺癌[1]。相对于男性而言，女性肺癌对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗的反应更好一些[2]，这表明EGFR和ER之间可能存在某种关联。本研究目的在于探讨雌激素受体ERα、ERβ及EGFR在我国肺癌进展组织芯片中的表达情况及其与肺癌的临床特点的关系，以及三者在肺癌中表达的相互关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取肺癌手术切除标本，癌前病变(不典型腺瘤样增生)12例，原发肺癌77例，淋巴结转移性肺癌12例。此77例原发肺癌标本临床资料完整，其中腺癌35例，鳞癌33例，大细胞癌9例(按2004年WHO肺癌组织学分类标准)；男性58例，女性19例；年龄45～75岁，中位年龄6l岁；周围型51例，中央型26例；有淋巴结转移者36例，无淋巴结转移者41例；高、中分化46例，低、未分化31例；Ⅰ～Ⅱ期48例，Ⅲ～Ⅳ期29例(根据P-TNM分期)。所有病例在肿瘤切除前均未进行放疗和化疗。

1.2 组织芯片制作方法 在显微镜下找出肿瘤组织切片中有代表性的区域，并在相应石蜡包埋组织切面上做标记。用0.6 mm组织穿刺针在每个标本的标记点分别取样，而后将其依次排列于模具内预融的石蜡中构成组织微阵列蜡块，待石蜡凝固后切制3～4 μm组织微阵列切片，将其粘附于玻片上，封蜡，4℃保存。

1.3 免疫组化Elivision两步法 单克隆兔抗人EGFR抗体为博士德生物公司产品，工作液浓度为1: 100；单克隆鼠抗人ERα抗体为基因科技有限公司产品，工作液浓度为1:100；多克隆兔抗人ERβ抗体为北京Bioss生物技术公司产品，工作液浓度为1:200；即用型第二代免疫组化Elivision plus广谱试剂盒，购自福州迈新生物技术开发有限公司。操作严格按照试剂盒说明书进行，用已知阳性切片做阳性对照，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定 对组织芯片中各点评分，根据细胞染色强度和染色细胞所占面积两者积分之和来判断。染色强度定性积分为：不着色为0，浅黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3；染色面积定量积分：无着色或＜5%为0，5%～24%为1，25%～50%为2，＞50%为3；两种积分相加为该点得分。对组织芯片中来自同一病例的各点的得分相加取平均值，依照0为-，1～2为+，3～4为++，5～6为+++，进行半定量判断；＞2(++和+++)为阳性，≤2(-和+)为阴性进行定性判断。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件包，临床病理参数间的比较采用行×列联表χ2检验或Fisher确切概率法、四格表χ2检验计算；显著性检验水准α=0.05。ERα、ERβ和EGFR之间的相关关系采用Spearman相关分析。

2 结果

2.1 肺癌进展组织芯片中ERα、ERβ和EGFR的表达差异 ERα阳性着色位于细胞核(图1)，ERβ阳性着色位于细胞核(图2)，EGFR阳性着色位于细胞浆/膜(图3)。ERα和ERβ在癌前病变中的表达高于原发肺癌及淋巴结转移性肺癌，在原发肺癌中的表达高于淋巴结转移性肺癌。在癌前病变、原发肺癌和淋巴结转移性肺癌中ERα和ERβ的表达阳性差异具有统计学意义(P＜0.01)。EGFR蛋白在癌前病变中的表达低于原发肺癌及淋巴结转移性肺癌，在原发肺癌中的表达低于于淋巴结转移性肺癌。在癌前病变、原发肺癌和淋巴结转移性肺癌中EGFR的表达阳性差异具有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

图1 ERα肺腺癌细胞核阳性表达(Elivision×100)

图2 ERβ肺鳞癌细胞阳性表达(Elivision×100)

图3 EGFR肺腺癌细胞浆/膜(Elivision×100)

表1 肺癌进展组织芯片中ERα、ERβ和EGFR的阳性表达率比较[例(%)]

2.2 原发肺癌中ERα、ERβ和EGFR的表达及其与临床病理学参数的关系 ERα、ERβ和EGFR在77例原发肺癌中的表达阳性见表2。结果显示，ERα和ERβ的表达与性别有关，在女性中的表达阳性率高于男性(P＜0.05)。ERα和ERβ蛋白的表达还与肺癌的组织学类型有关，在腺癌中的表达高于鳞癌(P＜0.05)，在大细胞癌中的表达低于腺癌和鳞癌，但这种差异无统计学意义(P＞0.05)。ERα和ERβ的表达阳性率随肿瘤分化程度的升高呈上升趋势，在肿瘤高、中分化组的表达阳性率高于低、未分化组(P＜0.05)。ERα和ER的表达阳性率随着P-TNM分期的进展呈下降趋势，在Ⅰ和Ⅱ期中的表达阳性率高于于Ⅲ和Ⅳ期(P＜0.05)。ER β的表达与是否有淋巴结转移有关，在无淋巴结转移组中的表达阳性率高于有淋巴结转移组(P＜0.05)。EGFR的表达阳性率与P-TNM分期有关，随着P-TNM分期的进展呈上升趋势，在Ⅰ和Ⅱ期中的表达阳性率低于Ⅲ和Ⅳ期(P＜0.05)。EGFR的表达阳性率在无淋巴结转移组中的表达低于有淋巴结转移组(P＜0.05)。ERα的表达阳性率与患者年龄、肉眼类型及肿瘤的淋巴结转移无关(P＞0.05)。ERβ的表达阳性率与患者年龄和肉眼类型无关(P＞0.05)。EGFR的表达阳性率与患者的性别、年龄、肉眼类型、组织学分型及肿瘤的分化程度无关(P＞0.05)。

表2 ERα、ERβ和EGFR在77例原发肺癌中的表达及其与临床病理学参数之间的关系

2.3 原发肺癌中ERα、ERβ和EGFR之间的相关性 Spearman等级相关分析显示，在原发肺癌中，ERβ和EGFR蛋白的表达呈正相关关系(r=0.612，P＜0.01)，ERα和ERβ、ERα和EGFR之间的表达无相关关系(rERα-ERβ=-0.058，P＞0.05；rERα-EGFR=-0.040，P＞0.05)。

3 讨 论

肺癌是全球常见的恶性肿瘤之一，但是总体治疗效果并不满意。近年来越来越多的研究发现，ER在非小细胞肺癌的发生发展过程中的确起着重要作用[3]。ER有两种亚型，即ERα和ERβ。ERα在非小细胞肺癌的表达情况在国内外各文献之间报道的差异较大，细胞核、细胞质均有阳性表达的报道[4]，而表达的阳性率也不同，本研究中ERα蛋白表达于癌前病变、原发肺癌及淋巴结转移性肺癌的细胞核。与Yun等[5]的报道一致。He等[6]认为在肺癌中不表达全长的ERα，但是检测到了变异的ERα。这可能是由于不同的检测方法、不同的抗体及ERα自身的变异造成的。对于ERβ蛋白在肺癌中的定位研究较一致，为细胞核。本研究中ERβ蛋白表达于癌前病变、原发肺癌及淋巴结转移性肺癌的细胞核。Mah等[7]认为ERβ的表达提示肺癌患者有长期的生存率。本研究结果显示ERα和ERβ在癌前病变、原发肺癌及淋巴结转移性肺癌的表达越来越低，随着肿瘤细胞分化程度的升高而上升，随着临床分期的进展而降低(P＜0.05)；ERβ在无淋巴结转移组的表达明显高于有淋巴结转移组(P＜0.05)，提示两者的失表达可能与肿瘤的恶性进展有关，从另一方面支持了以上说法。McHugh等[8]在分子水平的研究显示ERα mRNA在肺癌女性患者中的表达明显高于男性。本研究用免疫组化的方法在蛋白水平得到类似的结果，ERα和ERβ蛋白在肺癌女性患者中的表达明显高于男性，与Luo等[9]的研究一致。此外，本研究对ERα和ERβ在不同肺癌组织学分型的表达进行了分析，结果显示在腺癌中的表达高于鳞癌(P＜0.05)，与McHugh等[8]和Luo等[9]的研究相符，提示了ERα和ER β应用于肺癌靶向治疗的可能性。

ERβ与ERα在氨基酸序列和配体结合域有同源性，编码基因所在染色体不同，ERα位于6q25.1，ERβ位于14q23.2。ERα与ERβ在通过增强子元件的信号转录过程中介导的配体效应截然不同[10]。本研究结果显示，ERα和ERβ在肺癌中的表达无相关关系。因此可以推测，ERα和ERβ可能在基因调控中起不同作用。

EGFR属于细胞表面酪氨酸蛋白激酶受体erbB家族成员，是原癌基因c-erbB-1的表达产物，参与调控细胞代谢、增殖、肿瘤血管生成，促进细胞迁移和分化[11]。本研究发现癌前病变、原发肺癌及淋巴结转移肺癌中EGFR表达阳性率随肺癌的进展而升高，EGFR蛋白的表达随临床分期的进展而表达升高，在有淋巴结转移组中的表达与显著高于无淋巴结转移组(P＜0.05)，表明其在肺癌的发展及肿瘤细胞的浸润转移中起到了促进的作用，对这些指标的检测有可能为估计患者预后提供重要信息。有文献报道ER(包括ERα和ERβ)与EGFR之间有相互的作用[12]。这表明他们之间存在着共同的信号通路，而这些信号通路有可能为肺癌的生物学机制提供新的思路。本次试验发现ERβ与EGFR在肺癌的表达中呈正相关，而ERα与EGFR却没有明显的相关性，推测雌激素诱导的肺癌细胞的增殖可能是通过ERβ来实现的。

总之，雌激素受体ERα和ERβ及EGFR均与非小细胞肺癌的发生发展有关，且ERβ和EGFR的表达相关，这种潜在的机制及关联性可能为将来的进一步研究提供了基础。

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Expression and significance of estrogen receptor α,estrogen receptor β,and epidermal growth factor receptor in human lung cancer by tissue microarray.

CHEN Su-qin,YUAN Hai-hong.Department of Pathology,the People's Hospital of Wuqing District of Tianjin,Tianjin 301700,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression and biological significances of estrogen receptor α(ERα), estrogen receptor β(ERβ),and epidermal growth factor receptor(EGFR)in lung cancer.MethodsWe constructed a tissue microarray in which there were 12 cases of precancerous lesion,77 cases of primary lung cancer,and 12 cases of lung cancer with lymph node metastasis,and detected the expression of ERα,ERβ and EGFR in these specimens by using Elivision immunohistochemical method.ResultsThe positive rate of ERα was 91.67%in precancerous tissues, 62.34%in primary lung cancer and 25.00%in lung cancer with lymph node metastasis,and there were significant differences among them(P＜0.01).The positive rate of ERβ was 91.67%in precancerous tissues,55.84%in primary lung cancer and 16.67%in lung cancer with lymph node metastasis,and the differences were statistically significant(P＜0.01). The positive rate of EGFR was 25.00%,59.74%,and 91.67%,respectively,and the differences among them were significant(P＜0.01).In primary lung cancer,the expression of ERα was significantly correlated with gender,histological types,grade and P-TNM stage(P＜0.05),and the expression of ERβ was significantly correlated with gender,histological types,grade,P-TNM stage and lymph node metastasis(P＜0.05).The expression of EGFR was significantly correlated with lymph node metastasis and P-TNM stage(P＜0.05).Correlation analysis showed that there was a positive correlation between ERβ and EGFR(r=0.612,P＜0.01).ConclusionThe expression of ERα,ERβ and EGFR are related to the occurrence and development of lung cancer,and the expression of ERβ is correlated with EGFR.The underlying mechanism and potential translational relevance provide the foundation for further investigation.

Tissue microarray;Immunohistochemical;Lung cancer;Estrogen receptor α(ERα);Estrogen receptor β(ERβ);Epidermal growth factor receptor(EGFR)

R734.2

A

1003-6350（2017）04-0521-04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.04.002

2016-09-19)

天津市武清区科技发展计划项目（编号：WQKJ201214）

陈素琴。E-mail：sukeyar@163.com