胰岛素样生长因子-1在大鼠重症急性胰腺炎中的作用

王力波，杨志文，王静，翁成钊，徐萍

(1.南京医科大学，江苏 南京 210029；2.南京医科大学附属上海市松江区中心医院消化内科，上海 201600)

·论 著·

胰岛素样生长因子-1在大鼠重症急性胰腺炎中的作用

王力波1，杨志文2，王静2，翁成钊2，徐萍2

(1.南京医科大学，江苏 南京 210029；2.南京医科大学附属上海市松江区中心医院消化内科，上海 201600)

目的 观察胰岛素样生长因-1(IGF-1)在重症急性胰腺炎(SAP)大鼠中的治疗作用。方法将30只SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组、假手术组、SAP组、高剂量IGF-1组和低剂量IGF-1组，每组6只。采用改良的Aho法制作SAP模型，在造模6 h后处死大鼠，收集胰腺组织、外周血和腹水。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠血清细胞因子(IL-1β、IL-6)表达。Real-time PCR方法检测胰腺组织(TLR-4、MAPK p38、NF-κB p65) mRNA转录水平及蛋白水平变化。结果SAP组大鼠腹水量、转氨酶、血清及腹水淀粉酶和炎症细胞因子IL-1β、IL-6较正常对照组及假手术组显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)；经IGF-1干预后，大鼠腹水量、转氨酶、血清及腹水淀粉酶、IL-1β和IL-6较SAP组明显下降，且随IGF-1剂量的增加，大鼠腹水量、转氨酶、血清及腹水淀粉酶、IL-1β和IL-6下降更加显著，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论IGF-1能有效减轻SAP大鼠胰腺炎的病情。

胰岛素样生长因-1；重症急性胰腺炎；大鼠

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是临床常见的危重病症，有发病急、发展迅速、病情凶险、并发症多、病死率高等特点[1]。尽管随着现代医学的不断进步，SAP的临床治愈好转率逐年提高，但其总体死亡率仍高达15%左右[2]。目前认为SAP的发病始于胰腺腺泡细胞内的炎症反应，并促发机体产生级联反应[3]，进而引起全身炎症反应综合征(SIRS)及多器官功能衰竭(MODF)。p38MAPK是机体内重要的细胞内信号转导途径，可调节细胞因子及通过应急反应刺激诱导细胞的凋亡、分化及炎症反应等[4]，激活p38MAPK后可促进白介素-1β(IL-1β)、白介素-6 (IL-6)等炎症因子的大量释放，与SAP病情的进展关系紧密。有研究发现核转录因子κB(NF-κB)与p38MAPK信号通路可能存在着交互作用[5，6]。胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是由70多个氨基酸组成的单链多肽,具有调节机体代谢，促进细胞增殖等多种作用，本研究旨在初步研究IGF-1在重症急性胰腺炎大鼠中的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 雄性清洁级SD大鼠，体质量150～200 g，由上海交通大学附属第一人民医院动物实验中心提供；牛磺胆酸钠(上海生工生物工程技术服务有限公司)；胰岛素样生长因子IGF-1(Sigma，美国)；RNA提取试剂Trizol(Invitrogen，美国)；第一链cDNA合成试剂盒(大连宝生，美国)；ABI 7500型定量PCR仪(Applied Biosystems)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型建立 30只健康雄性SD大鼠随机分为：正常对照组、假手术组、SAP组、高剂量IGF-1组，低剂量IGF-1组，每组6只。SAP组以1 mL/kg体质量的5%牛磺胆酸钠经大鼠胰胆管逆行注射的方法制作。假手术组翻动大鼠胰腺并以钝器轻微划动胰腺3次后关腹。低剂量IGF-1组造模同SAP组并于术前30 min及术后30 min分别皮下注射20µg/kg IGF-1，高剂量IGF-1组造模同SAP组并于术前30 min及术后30 min按分别皮下注射200µg/kg IGF-1。正常对照组、假手术组、SAP组、高剂量IGF-1组、低剂量IGF-1组6 h后分别处死6只大鼠并立即心脏取血，收集腹水标本记录腹水量，收集大鼠胰腺组织。

1.2.2 标本处理 收集的血液，4℃冰箱静置3 h后以3 000 r/min离心10 min后取血清分成两部分，一部分存于-80℃冰箱中用于酶联免疫吸附试验(ELISA)，一部分送检测定血清淀粉酶、LDH、转氨酶。大鼠胰腺组织分成两部分，一部分置于-196℃液氮罐保存，用于胰腺病理检测，一部分用于实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测。

1.2.3 病理检测 取部分胰腺组织10%甲醛液固定后切成4µm厚的切片，常规HE染色。胰腺组织常规石蜡包埋切片，苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜观察组织病理改变，每片随机选取8～10个高倍视野，采用Schimidt等[7]标准从水肿、炎症细胞浸润、出血和脂肪坏死程度4个方面进行评分，4个评分相加为总评分。

1.2.4 Real-time PCR 外周血总RNA提取及TLR4、p38MAPK、NF-κBp65 IGF-1R mRNA表达检测，按Trizol提取总RNA，按逆转录试剂盒操作说明书将总RNA逆转录为cDNA。Real-time PCR在7300实时荧光定量PCR仪(ABI)上进行，采用两步法，进行引物扩增。检索NCBI网站GeneBank查询TLR4、p38MAPK、NF-κB p65、IGF-1R mRNA及GAPDH的mRNA序列。利用Primer Express软件设计引物，TLR4上游引物：5'ATGCTAAGGTTGGCACTCTC3'，下游引物5'CAGGCAGGAAAGGAACAATG3'；NF-κB p65上游引物5'AGACCTGGAGCAAGCCATTAG3'，下游引物5'CGGACCGCATTCAAGTCATAG3'；p38MAPK上游引物5'TTCCCAGCAGTCCTATCC3'，下游引物5'CAGATGGCAAGGGTTCAG3'；GAPDH上游引物5'GTCGGTGTGAACGGATTTG3'，下游引物5'TCCCA TTCTCAGCCTTGAC3'；IGF-1R上游引物5'CGCAGG ATGGCTATCTGTTC3'，下游引物5'ATCACCACCGC ACACTTC3'。反应条件为：预变性95℃10 min，然后按95℃15 s，60℃60 s，进行40个循环。GAPDH为内参，将目的基因Ct值减去内参Ct值作为△Ct值，不同标本采用2-△△Ct值进行比较，表示mRNA的相对表达量。

1.2.5 血清细胞因子(IL-1β、IL-6)表达水平的检测 采用ELISA检测血清炎症因子(IL-1β、IL-6)的水平，抗大鼠IL-1β、IL-6单抗包被于酶标板上标本和标准品中的IL-1β、IL-6会与单抗结合，洗去游离的成分，加入生物素化的抗大鼠IL-1β、IL-6抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素生物素与亲和素特异性结合；抗大鼠IL-1β、IL-6抗体与结合在单抗上的大鼠IL-1 β、IL-6结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色剂，37℃避光显色15 min，以空白空调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出标本浓度，再乘以稀释倍数，即为标本中IL-1β、IL-6的实际浓度。

1.3 统计学方法 应用SPSS20.0统计学软件包进行数据分析，采用GraphPad Prism5软件作图。正态分布计量资料以均数±标准差(±s)表示，偏态分布采用M(P25，P75)表达，非正态分布数据两组间比较采用非参数检验Mann Whitney分析，胰腺组织病理损伤及评分、胰腺组织TLR4、p38MAPK、NF-κB p65 mRNA转录水平变化、胰腺组织IGF-1R mRNA转录水平变化、ELISA检测比较采用单因素方差分析(LSD)。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 腹水量、血清及腹水淀粉酶水平观察 SAP组大鼠术后6 h的腹水量、血清及腹水淀粉酶、血清转氨酶水平较假手术组和正常对照组明显增高(P＜0.05)；注射低剂量IGF-1后的同时段的腹水量、血清及腹水淀粉酶、血清转氨酶水平较SAP组降低(P＜0.05)，见表1。注射高剂量IGF-1后同时段的血清、腹水淀粉酶水平、血清转氨酶较SAP组降低(P＜0.05)，也较低剂量IGF-1组低(P＜0.05)。

2.2 胰腺组织病理损伤及评分 胰腺组织病理：正常对照组(图1A)大鼠胰腺组织结构完整，未见间质充血、出血和腺泡细胞坏死。假手术组(图1B)大鼠胰腺组织结构清晰，绝大部分腺泡小叶完整，偶见炎性细胞和红细胞浸润，未见腺泡细胞坏死。SAP组(图1C)大鼠胰腺组织可见腺泡细胞变性、坏死明显增多，小叶结构破坏明显，间隔间隙增大，细胞间隙水肿，红细胞和炎性细胞浸润增多，且病理评分显著增高。注射低剂量IGF-1后(图1D)的胰腺病理损伤较SAP组好转，腺泡细胞变性、坏死稍有减少，小叶结构破坏仍明显，间隔间隙增大，细胞间隙水肿，有红细胞和炎性细胞浸润，评分均较SAP组降低(P＜0.05)。注射高剂量IGF-1后(图1E)的胰腺病理损伤显著减轻，其细胞坏死、小叶结构破坏、红细胞和炎性细胞浸润均明显减轻，其评分均较SAP组、低剂量治疗组显著降低(P＜0.05)。图1示各组病理切片，表2示各组病理评分。

表1 各组大鼠腹水量、血清淀粉酶、腹水淀粉酶、血清AST、血清ALT(±s)

表1 各组大鼠腹水量、血清淀粉酶、腹水淀粉酶、血清AST、血清ALT(±s)

注：SAP组、低剂量IGF-1组、高剂量IGF-1组vs正常对照组和假手术组：aP＜0.05；低剂量IGF-1组、高剂量IGF-1组vs SAP组：bP＜0.05，高剂量IGF-1组vs低剂量IGF-1组：CP＜0.05。以M(P25，P75)表示。

组别正常对照组假手术组SAP组低剂量IGF-1组高剂量IGF-1组腹水量(mL) / 1.66±0.33 9.75±0.77a5.66±0.69ab5.67±0.84abAMS(IU/L) 340.00(148.50，827.75) 643.00(606.75，420.50) 31 398.00(24 265.00，38 429.00)a24552.50(17 219.25，38 478.25)ab24394.0(21 801.50，30 171.00)abc腹水淀粉酶(IU/L) / 1354.33±119.98 5083±526.42a 4567.8±168.47ab4267.4±119.42abcAST(IU/L) 134.57±16.00 164±8.33 749.75±133.95a537.4±145.89ab358±65.43abcALT(IU/L) 53.38±4.38 49±1.77 311±107.45a226.2±88.18ab120.67±23.67abc

图1 胰腺病理(×200)

表2 各组大鼠胰腺组织病理评分(±s)

表2 各组大鼠胰腺组织病理评分(±s)

注：SAP组、低剂量IGF-1组、高剂量IGF-1组vs正常对照组和假手术组：aP＜0.05;低剂量IGF-1组、高剂量IGF-1组vs SAP组：bP＜0.05，高剂量IGF-1组vs低剂量IGF-1组：cP＜0.05。

组别正常对照组假手术组SAP组低剂量IGF-1组高剂量IGF-1组胰腺病理评分0.65±0.50 1.10±0.50 11.71±1.01a8.60±0.68ab6.15±1.95abc

2.3 胰腺组织TLR4、p38MAPK、NF-κ B p65 mRNA转录水平变化 SAP组胰腺组织的TLR4、p38MAPK、NF-κBp65 mRNA转录水平明显升高(P＜0.05)，低剂量IGF-1组胰腺组织的TLR4、p38MAPK、 NF-κBp65 mRNA转录水平较SAP组降低(P＜0.05)，见图2，注射高剂量IGF-1后同时段的TLR4、p38MAPK、NF-κBp65 mRNA转录水平较SAP组降低(P＜0.05)，高剂量IGF-组后同时段TLR4、p38MAPK、NF-κBp65 mRNA转录水平也较低剂量IGF-1组低(P＜0.05)。

2.4 胰腺组织IGF-1R mRNA转录水平变化 SAP组术后6 h的IGF-1R mRNA转录水平较假手术组和正常对照组明显下降，正常对照组与SAP组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；注射不同浓度IGF-1后，随注射浓度提高，IGF-1R mRNA转录水平逐渐升高，低剂量组及高剂量组与SAP组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

图2 胰腺组织TLR4、p38MAPK、NF-κBp65 mRNA转录水平

图3 胰腺组织IGF-1R mRNA转录水平

2.5 ELISA检测 SAP组大鼠术后6 h的细胞因子IL1-β、IL-6水平较正常对照组和假手术组明显增高(P＜0.05)；注射低剂量IGF-1后IL1-β、IL-6较SAP组降低(P＜0.05)(表3)，注射高剂量IGF-1后IL1-β、IL-6较SAP组降低(P＜0.05)，也较低剂量IGF-1组低(P＜0.05)。

表3 各组大鼠血清细胞因子(IL-1β、IL-6)

3 讨 论

IGF-1是由70多个氨基酸组成的单链碱性蛋白，编码基因位于第12号染色体，分子量7 648，主要由肝细胞分泌和合成，是生长因子大家族中的一员。IGF-1对机体生长发育起重要的调节作用，且在缺血后再灌注等多种病理状态下对机体发挥重要的保护作用[8]。危重患者中，创伤应激性反应使分解代谢加快，炎症/抗炎性细胞因子比例随血清IGF-1水平降低而逐渐升高，从而增加患者多器官衰竭发生的风险[9]。同时，肝合成IGF-1速度与营养素成正相关，当发生重症急性胰腺炎时机体处于负氮平衡，导致IGF-1合成减少，本研究也发现急性胰腺炎大鼠模型IGF-1受体水平下降，这与以往研究是一致的。

p38MAPK、NF-κB等细胞信号传导通路由于能调控炎症反应，近年来在SAP发生、发展中的作用越来越受到重视。大量研究显示NF-κB、p38MAPK等通路的激活可刺激机体产生大量促炎细胞因子，并促发炎症的级联瀑布反应。Gray等研究发现敲除NF-κB基因的大鼠能够较好的抵抗雨蛙肽诱导的急性胰腺炎[10]；Samuel等通过结扎主胰管的方法建立大鼠AP模型，采用免疫印迹法检测胰腺组织p38MAPK表达，结果显示造模后大鼠胰腺组织中p38MAPK活性明显增加[11]。

Ghrelin能够促进生长激素(growth hormone，GH)分泌，而目前研究发现GH、IGF-1对急性胰腺炎有明确的治疗作用，Ceranowicz等[12]研究发现切除垂体的胰腺炎模型大鼠，IGF-1对其治疗效果与Ghrelin治疗效果大鼠类似，且Ghrelin对胰腺炎的治疗作用是间接的，依赖于生长激素和IGF-1的释放。而目前也有研究发现Ghrelin可通过抑制NF-κBp65表达减轻急性胰腺炎[13]；通过抑制p38通路而间接抑制TNF-a表达[14-15]。故笔者推测IGF-1可能作用于NF-κB通路和MAPK通路，使这两条通路活化程度减弱，从而减轻急性胰腺炎病情。

本研究发现：急性胰腺炎模型大鼠注射IGF-1后，大鼠血清淀粉酶、腹水淀粉酶、血清转氨酶AST、血清ALT、大鼠腹水量、病理损伤及评分均明显下降，且随着IGF-1注射浓度升高，下降更明显；说明注射IGF-1 SAP模型大鼠后，SAP模型大鼠炎症能够减轻。

急性胰腺炎模型大鼠注射IGF-1后，随着IGF-1注射浓度升高，大鼠胰腺组织TLR4、p38MAPK、NF-κB p65 mRNA转录水平SAP组降低，随着IGF-1注射剂量增加，TLR4、p38MAPK、NF-κB p65 mRNA转录水平较SAP组降低的更明显。从以上结果我们可以得出IGF-1使急性胰腺炎大鼠炎症减轻可能作用于NF-κB通路和MAPK通路，使这两条通路活化程度减弱，而在N-κB通路上，可能通过TLR4表达减少从而使NF-κB通路活化程度减弱。

综上所述，IGF-1可能通过抑制NF-κB p65和p38表达，从而使这两条通路活化程度减弱，TLR4、p38MAPK、NF-κB p65 mRNA转录水平降低，IL-1β、IL-6等炎症因子释放减少，从而减轻急性胰腺炎病情，其具体机制需进一步探讨研究。

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Effects of insulin-like growth factor-1 in the treatment of severe acute pancreatitis.

WANG Li-bo1,YANG Zhi-wen2, WANG Jing2,WENG Cheng-zhao2,XU Ping2.1.Nanjing Medical University,Nanjing 210029,Jiangsu,CHINA;2. Department of Gastroenterology,Shanghai Songjiang District Central Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Shanghai 201600,CHINA

ObjectiveTo observe the effects of insulin-like growth factor-1(IGF-1)in the treatment of severe acute pancreatitis(SAP).MethodsThirty SD rats were randomly divided into five equal groups(n=6 each):normal group,sham operation group,SAP group,high dose IGF-1 group and low dose IGF-1 group.The SAP model was established by the modified Aho method.Rats were sacrificed 6 h after modeling for collection of pancreatic tissues,peripheral blood and ascites.The expression status of the serum cytokines(IL-1β,IL-6)was detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Real-time PCR was used to detect the changes in TLR-4,MAPK p38 and NF-κB p65 mRNA and protein levels in pancreatic tissues.ResultsIn the SAP group,there were significant increases in ascites volume, transaminases,serum and ascites amylase,IL-1β and IL-6,compared with those in the normal group and control group (P＜0.05).IGF-1 intervention resulted in significant decreases in ascites volume,transaminases,serum and ascites amylase,IL-1βand IL-6,compared to those in the SAP group,and there were greater decreases in ascites volume,transaminases,serum and ascites amylase,IL-1β and IL-6 with increasing IGF-1 dose(P＜0.05).ConclusionIGF-1 could effectively alleviate pancreatitis in SAP rats.

Insulin-like growth factor-1;Severe acute pancreatitis;Rats

R-332

A

1003-6350（2017）04-0517-05

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.04.001

2016-09-12)

南京医科大学科技发展基金资助基金(编号：2012-III-58）

徐萍。E-mail：sjzxxp@yeah.net