核输出蛋白在流感病毒感染与传播中的作用

方迪　郭潮潭

[摘要] 核输出蛋白（NEP）是一个由甲型流感病毒第8段基因编码的约为14 kD的蛋白。NEP最初被认为参与病毒核糖核蛋白复合体的出核。相对于流感病毒的其他几个蛋白，关于NEP的研究很少被报道。近年来，随着蛋白立体结构的确定、研究的不断深入，NEP在流感病毒活动中很多意想不到的作用不断被发现。这些研究显示NEP参与病毒的转录和复制，促进H5N1禽流感病毒在哺乳动物体内的适应以及参与病毒的出芽。本文系统总结了NEP的功能，包括参与病毒核糖核蛋白复合体的出核的过程、调节病毒聚合酶的活性以及帮助H5N1禽流感病毒实现跨种间传播等，为进一步研究NEP奠定基础。

[关键词] 流感病毒；核输出蛋白；蛋白结构；生物特性

[中图分类号] R511.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）01（c）-0035-05

[Abstract] Nuclear export protein （NEP） is a protein encoded by segment eight of influenza A virus， about 14 kD. NEP was originally implicated in mediating the nuclear export of viral ribonucleoprotein complexes. In contrast to other influenza virus proteins， NEP studies are rarely reported. Since then， with the determination of protein structure and the deepening of research， many unexpected roles for NEP during the influenza virus life cycle have begun to be discovered. These recent studies have shown NEP to be involved in regulating viral transcription and replication， facilitating the adaptive processes of avian H5N1 influenza viruses in the mammalian hosts and efficiently releasing budding virions. The paper reviews the function of NEP that mediating the nuclear export of viral ribonucleoprotein complexes， regulating the viral polymerase activity and facilitating the inter-species transmissions of avian H5N1 influenza viruses etc.， which provides a basis to further study.

[Key words] Influenza virus； Nuclear export protein； Protein structure； Biological properties

流感病毒属于正黏病毒科，是引起世界流感大流行的主要病原体，可以引起人畜共患的疾病。甲型流感病毒可以通过抗原漂移和抗原转换，不断地进行变异来逃避免疫系统的攻击，且目前使用的抗流感药物和疫苗都具有局限性，无法从根本上来解决问题。随着对流感病毒新靶点的寻找，核输出蛋白（NEP）越来越被人们所了解和重视。本文主要对NEP的研究进行归纳和总结，希望能对流感病毒本身和抗流感病毒的研究提供幫助。

1 NEP的概况

甲型流感病毒的基因组是由8段负链RNA组成，一般可以编码17种不同的病毒蛋白，某些毒株可能存在18种不同的病毒蛋白[1]。NEP是流感病毒NS基因编码的4种蛋白之一[1-2]。NEP是前体mRNA剪接后的翻译产物，只有121个氨基酸组成，主要参与新生病毒核糖核蛋白（viral ribonucleoproteins，vRNPs）复合体的出核。NEP最初被认为只存在被感染的细胞中，结构也没有确定，故命名为NS2（non-structural protein 2），直到1991年Richardson等[3]在纯化的病毒颗粒中找到了NS2蛋白，被证明是一种病毒的结构蛋白，而后O'Neill等[4]发现在细胞核内新合成的vRNPs在出核的过程中NS2蛋白起到了关键性作用，所以重新命名为NEP（nuclear export protein）。NEP与宿主之间存在着紧密的联系，通过酵母双杂交实验已经证明至少存在39种与NEP存在相互作用的宿主蛋白[5-6]。宿主通过自身蛋白与NEP的直接作用来影响流感病毒的生命周期，同时病毒也可以通过NEP与宿主蛋白的作用来影响细胞的生长发育、代谢等生命活动。

2 NEP的蛋白结构

如图1所示，NS基因是流感病毒的第8段基因，全长约890个核苷酸，主要负责编码NEP和NS1蛋白，某些病毒株还能编码NSP和NS3蛋白[7-8]。流感病毒的转录在细胞核中进行，在转录过程中利用细胞的pre-mRNA的5'帽子结构来作为病毒转录的引物[9]，然后病毒mRNA进入胞质借助细胞的翻译系统来合成病毒蛋白。NS基因可直接转录产生NS1 mRNA，NS1 mRNA上存在着剪接供位和剪接受位，在真核细胞内经RED-SMU1剪接体作用后切去一段472个核苷酸长度的内含子生成NEP-mRNA[10-11]，接着进入胞质合成NEP。

NEP由121个氨基酸组成（图2）。人为条件下用蛋白酶对NEP进行水解，NEP可分为对蛋白酶敏感的N端（第1～53位氨基酸残基）和对蛋白酶耐受的C端（第54～121位氨基酸残基）[12]。C端由两个α螺旋组成，即C1（第64～85位氨基酸残基）和C2（第94～115位氨基酸残基），中间由小弯链接，形成反向平行的螺旋发夹结构，这个结构使得C末端具备了既亲水又疏水的两性特征[12]。第78位存在着一个色氨酸残基，周围围绕着多个谷氨酸残基，这些谷氨酸残基可以和M1蛋白的核定位信号（nuclear localization signal，NLS）序列产生静电作用，对于NEP参与vRNPs的出核活动非常重要[13]。虽然对N端的结构还不是很清楚，通过其他实验已经证明蛋白的出核信号（nuclear export signal，NES）序列存在于蛋白的N端[14-15]。近年来，NEP的翻译后修饰也越来越被人们所重视，如包括NEP在内的多种病毒蛋白都会受到细胞的类泛素化修饰；NEP可以通过磷酸化来调节自身的功能等[16-17]。

3 NEP的生物特性

3.1 NEP促进vRNPs的出核

如图3所示，促进vRNPs的出核是NEP的主要生物功能。流感病毒的RNA以vRNPs复合体的形式存在，vRNPs复合体由病毒RNA、NP蛋白和三种病毒聚合酶（PB1、PB2和PA）共同组成，vRNP的分子量很大，不能直接通过细胞核的核孔[18]，需要在NEP、M1和宿主蛋白的共同作用下运输到胞质。类似于NEP的功能，首先见于对HIV-1的Rev蛋白的研究，Rev蛋白主要负责介导病毒mRNA的出核[19]。Rev蛋白上有NES序列[19]，它能被出核受体蛋白Crm1蛋白（chromosome region maintenance 1 protein）所识别[20]。Crm1蛋白属于karyopherin-β（Kapβ）受体家族，是细胞内最主要的出核受体蛋白，负责核质之间的蛋白和RNA的转运，Crm1蛋白能特异地识别靶蛋白上的NES序列并与其结合，由它负责转运的蛋白多达数百种[21]。不过与Rev蛋白相比，NEP的NES序列的发现经历了一个相对漫长的过程，第一个序列被证明距第二个序列被证明相差了十多年，NES1序列为12ILLRMSKMQL21（A/PR8/34）[4]，NES2序列为31MIT QFESLKL40（A/PR8/34）[15]，这两个NES序列都位于蛋白的N端，NEP通过N端的NES序列与Crm1蛋白相结合。HIV-1的mRNA存在一段Revresponseelement序列可以和Rev蛋白相结合，形成Crm1-Rev-mRNA三聚体，HIV-1的mRNA组成复合体从胞核运输到胞质[22]，在胞质中合成病毒蛋白。与Rev蛋白不同的是，NEP运输vRNPs并不是直接和vRNA作用，这中间还有M1蛋白的参与。M1蛋白的C端可以直接和vRNP中的NP蛋白和vRNA相互作用[22]，N端存在NLS序列，101RKLKR105，在与NEP的结合中起到关键作用，对其中的4个氨基酸进行突变后会大大减弱与NEP的结合力[9]。NEP的C端除了与M1蛋白结合外还存在PB1和PB2蛋白的结合位点，NEP与病毒聚合酶的作用增加了这个复合体的稳定性，所以vRNP-M1-NEP-Crm1复合体并不是一个简单的串联体[23]。当vRNP-M1-NEP-Crm1出核复合体到达核周时，Crm1蛋白可以和核孔复合物上的多种核孔蛋白相互作用，通过出核复合体和核孔蛋白的作用将vRNP-M1-NEP复合体从核质转移到胞质，完成vRNPs的出核[24-25]。当然要顺利完成vRNPs出核还需要其他细胞因子的参与，如RanGAP1、RanGTP、RanBP3等[26]。宿主蛋白AIMP2在vRNPs的出核过程中与NEP也存在着相互作用，AIMP2是一种肿瘤抑制因子，NEP可以保护AIMP2逃避泛素介导的蛋白降解，而AIMP2又可使M1蛋白的泛素化修饰转为类泛素化修饰，让M1蛋白变得更加稳定[27]，NEP通过与AIMP2的作用保护了M1蛋白，促进了vRNPs的出核。Hu等[28]还发现NEP通过NES1序列与CHD3（Chromodomain helicase-DNA-binding protein 3）相互作用来促进vRNP的出核。隨着NEP相关研究的逐渐进展，会有越来越多有关vRNPs出核的宿主因子被发现。

3.2 NEP调节病毒的转录和复制

多个研究报道提示NEP也参与病毒的转录和复制。NEP除了在介导vRNPs出核中充当适配器的作用外，同时也是病毒聚合酶辅因子。NEP的C端存在着能与PB1和PB2蛋白结合的位点，NEP通过与PB1和PB2蛋白的相互作用参与调节病毒的转录和复制[23]。在人感染H5N1禽流感病毒中，NEP第16位氨基酸变异（M16I），使得禽流感病毒能适合人感染，提示NEP也参与禽流感跨种间传播和感染[29]。禽流感病毒的某些基因（如PB2-E627K）发生突变使得禽流感病毒在哺乳动物细胞内也具有较高的复制能力，从而打破种间屏障传播感染人类[30]。Mnz等[29]发现存在一部分人源性H5N1流感病毒仍然保留了第627位的谷氨酸（PB2-E627），而它的NEP一般会有相应的适应性突变，如M16I，突变后的NEP能更有效地提高聚合酶活性来补偿PB2蛋白，以此来满足H5N1流感病毒在哺乳动物细胞内进行复制的要求。后面，Reuther等[31]通过实验证明突变（M16I）后的NEP的分子结构更适合流感病毒在哺乳动物细胞内进行复制。NEP一般可以通过N端与C端的相互作用形成一个折叠状态的分子，并且这种分子内的折叠又与温度有关，一般在较低温度下NEP更倾向于折叠且折叠状态会更加稳定[31]。流感病毒在人类的感染部位以上呼吸道为主，而禽鸟以消化肠道为主，人类上呼吸道温度较低（32～34℃），而禽类消化道的温度较高（39～41℃）。突变（M16I）后的NEP在低温环境中更耐受，使得不那么容易形成折叠状态。在未折叠的状态下，蛋白的C端可以用来和PB1、PB2蛋白相互作用，刺激病毒聚合酶，提高病毒的复制能力，使得流感病毒可以在哺乳动物细胞内进行复制，破除种间屏障[31]。不过NEP提高病毒聚合酶活性的特性也不是绝对的，低浓度的NEP虽然可以刺激病毒聚合酶的活性，但高浓度的NEP也会反过来抑制病毒的复制[29-32]。对NEP功能的研究还只是处于起步阶段，阐明NEP调节病毒转录和复制的机制还需要更多的实验来证明。

3.3 NEP参与病毒的出芽

NEP参与病毒出芽也是NEP的主要功能之一[33]。NEP可以同宿主蛋白相互作用来影响流感病毒的出芽。NEP和细胞膜上F1Fo-ATPase的β亚基存在着作用，而F1Fo-ATPase的ATP酶活性在流感病毒出芽的过程中起到了很重要的作用[33]。王朝霞等[34]利用反向遗传技术获得的NEPE67SPR8突变病毒株在鸡胚增殖后，不论是病毒的效价还是HA的表达量都有明显的提升。另一个研究发现PR8毒株的NEPK86R突变同样可以加速病毒颗粒的形成，突变后的NEP并不改变vRNPs的出核及病毒的转录和复制[35]，其机制可能与突变后的NEP与宿主的F1Fo-ATPase、FoB和F1β这三个因子的相互作用增强有关，从而促进了病毒颗粒的形成。

3.4 NEP参与细胞信号转导

流感病毒被发现与细胞内的多条信号通路有关系，其中被研究的最多的是Raf/MEK/ERK信号通路[36-38]。当细胞感染流感病毒以后会激发细胞内的Raf/MEK/ERK信号通路，Raf/MEK/ERK信号通路的激发会引起很多效应，如TNF-α的大量表达，TNF-α被认为是一种具有抗流感病毒作用的细胞因子[36]。流感病毒感染会激发细胞内的Raf/MEK/ERK信号通路，反过来抑制Raf/MEK/ERK信号通路会导致NEP失去功能，vRNPs在核内大量滞留[37]。转染了NEP的细胞TNF-α的mRNA和蛋白表达水平有很明显的提升，可能与NEP涉及Raf/MEK/ERK信号通路有关[38]。NEP与Raf/MEK/ERK信号通路的具体关系到目前还不是很清楚。

4 展望

甲型流感病毒流行一百余年，至今尚未彻底征服，且每年冬春都会流行，奪去数以万计的生命。流感的预防还是以接种疫苗为主，治疗以M1离子通道抑制剂（金刚胺类）和NA抑制剂（达菲类）药物为主。然后因流感病毒容易变异使得疫苗预防没有达到应有的作用，药物也出现耐药，治疗效果不理想。也有报道药物出现副作用，如达菲（奥司他韦）是目前最广泛使用的抗流感药物，但服用达菲有时会出现一些精神方面的症状[39]，而且病毒抗药性的出现也使得传统抗流感药物的作用越来越有限[40]。随着NEP生物特性的不断呈现，NEP作为抗病毒药物的靶点也越来越受到重视。如上面提到流感病毒在细胞内的活动和细胞的信号通路有关，Haasbach等[41]联合奥司他韦和MEK抑制剂在抗甲型流感病毒的体外实验中取得了不错的效果。NEP在流感病毒中扮演着重要的角色，同时也和细胞的信号通路有着密切联系，发明一种以NEP为新靶点的新型抗流感药物来对付一部分耐药的流感病毒具有很大的潜力。又如对NEP的改造[31，34-35]，使得病毒对稳定敏感，得到低温培养毒株，或是对改良流感疫苗的开发，也有启明作用。

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（收稿日期：2016-11-01 本文編辑：张瑜杰）