光质、光强和外植体对虎杖愈伤组织增殖及白藜芦醇积累的影响

肖林霞+卢其能+李润根

摘要：研究了光质、光强、外植体来源对虎杖愈伤组织增殖及其白藜芦醇积累的影响。结果表明，绿光和黄光有利于虎杖愈伤组织增殖，蓝光最适合于愈伤组织中白藜芦醇的积累；长期培养条件下，弱光和中强光比强光更利于白藜芦醇的积累；以茎段作为外植体，虎杖愈伤组织的增殖速度和白藜芦醇含量都明显高于叶片和叶柄。

关键词：虎杖；愈伤组织；白藜芦醇；光质；光强；外植体

中图分类号： S567.23+9.043 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）11-0060-04

白藜芦醇（resveratrol）是一种具有多种生物活性的非黄酮类多酚化合物，是植物受到外界刺激而产生的一种植物抗毒素，主要存在于虎杖、葡萄、花生等植物中，且在虎杖根茎中含量最高。白藜芦醇不仅能提高植物的抗病性，还具有多种有益于人类健康的药理作用，主要包括抗氧化、抗肿瘤、抗炎抗菌、抗衰老、预防心血管疾病、雌激素作用、保护肝脏等[1-2]。因此，白藜芦醇不仅能用于医药和保健品市场，还能用于化妆品市场，需求量大。目前，白藜芦醇的主要来源依然是从天然植物中提取，为了防止植物资源被过度采挖，已有较多的利用生物技术（如组织培养、生物转化和转基因等技术）来生产白藜芦醇的研究。但光质、光强、外植体对虎杖愈伤组织生长及其白藜芦醇含量的影响还鲜有报道。因此，本试验研究了LED光质、光强、外植体来源对虎杖愈伤组织增殖及其白藜芦醇含量的影响，旨在获得适合虎杖愈伤组织白藜芦醇积累的光照条件和外植体来源，为将来利用组织培养技术大规模生产白藜芦醇提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

虎杖采自江西省吉安市新干县。

1.2 方法

1.2.1 虎杖愈伤组织的诱导

取虎杖的幼嫩茎段，消毒后接至快繁培养基中，获得无菌小苗后将其接至生根培养基中，获得虎杖幼苗。按曹庸等诱导虎杖愈伤组织的方法[3]，略作改动进行愈伤组织诱导。将无菌幼苗的叶片剪成适当大小，叶柄和茎段切至适当长度，接至愈伤诱导培养基（MS+0.3 mg/L KT+1.0 mg/L 2，4-D）中，黑暗条件下培养，温度为（25±1） ℃。约20 d后即得到愈伤组织，并用该培养基进行继代。

1.2.2 LED光质对虎杖愈伤组织增殖及其白藜芦醇积累的影响

将来源于叶片的5块大小一致的虎杖愈伤组织接至上述愈伤组织诱导培养基中，置于绿、蓝、红、黄、白LED光照及黑暗下培养，光照强度为3 000 lx，温度为（25±1） ℃，每处理重复15瓶。在培养6、12、18、24、30 d后，随机取不同光质及黑暗条件下的愈伤组织3瓶，合并同一处理下的愈伤组织，称其总质量，计算愈伤组织增殖倍数，提取并测定其白藜芦醇含量，再根据愈伤组织质量，计算白藜芦醇总量。本试验重复3次。

1.2.3 光照强度对虎杖愈伤组织增殖及其白藜芦醇积累的影响

将来源于叶片的5块大小一致的虎杖愈伤组织接至上述愈伤组织诱导培养基中，置于不同光强的蓝色LED光质下培养，光照强度分别为1000、3 000、5 000 lx，温度为（25±1） ℃，每处理重复15瓶。随后的处理同光质组。

1.2.4 外植体来源对虎杖愈伤组织增殖及其白藜芦醇积累的影响

分别将来源于叶片、叶柄、茎段的5块大小一致的虎杖愈伤组织接至上述培养基中，置于相同光照强度的蓝色LED光质下培养，光照强度为3 000 lx，温度为（25±1） ℃，每处理重复15瓶。随后的处理同光质组。

1.2.5 虎杖愈伤组织白藜芦醇的提取与测定

1.2.5.1 白藜芦醇的提取

参考刘小丽等超声提取虎杖中白藜芦醇的方法[4]，稍作改动。精确称取2 g虎杖愈伤组织，用研钵捣碎研磨成匀浆后转移到100 mL的锥形瓶中，加入20 mL 85%的乙醇，超声波50 ℃提取30 min后，减压抽虑得到澄清的提取液，再用旋转蒸发仪50 ℃浓缩至干，加入1 mL甲醇超声溶解，并用0.45 μm的有机滤膜过滤即得供试品溶液，置于4 ℃保存备用。

1.2.5.2 白藜芦醇的检测

白藜芦醇的含量使用安捷伦1200系列液相色谱系统测定。色谱柱为C18（150 mm×4.6 mm），流动相采用甲醇-重蒸水（35 ∶65）混合溶剂，流速为0.8 mL/min，检测波长为306 nm，每次进样10 μL，柱温为30 ℃。

1.2.5.3 白藜芦醇标准曲线的制定

精确称取10 mg白藜芦醇标准品，用甲醇溶解并定容至100 mL，得到浓度为 100 μg/mL 的对照品溶液，分别吸取该溶液1、2、3、4、5、6、7 mL，并定容至50 mL，即得浓度分别为2、4、6、8、10、12、14 μg/mL 的对照品溶液。依次取10 μL进样后，以测得的白藜芦醇峰的峰面积（y）为纵坐标，以白藜芦醇浓度（x）为横坐标进行线性回归，得到回归方程为y=85.377x-83.386，r2=0.999 3。

供試品溶液按与对照品溶液相同的色谱条件进样，获得白藜芦醇供试品溶液和对照品溶液的色谱图（图1、图2），根据峰面积计算供试品溶液中白藜芦醇的含量。

2 结果与分析

2.1 LED光质对虎杖愈伤组织增殖及其白藜芦醇积累的影响

2.1.1 LED光质对虎杖愈伤组织增殖的影响

LED光质对虎杖愈伤组织增殖有明显影响。各条件下愈伤组织的增殖速率均是先变快后减慢，总体上增殖效果为绿光、黄光>蓝光>红光、白光>黑暗，绿光略大于黄光，红光略大于白光（图3）。由此可见，光照有利于愈伤组织的增殖，且单色光效果强于白光。

2.1.2 LED光质对虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的影响

除在黑暗条件下虎杖愈伤组织中白藜芦醇的含量一直变化不大外，光照条件下白藜芦醇的含量均是在培养6 d后最高，之后逐渐下降趋于稳定。但蓝光下白藜芦醇的含量一直明显高于其他条件，光质条件下白藜芦醇的含量总体上是蓝光>黄光>白光>红光>绿光>黑暗（图4）。由此可见，光照有利于白藜芦醇的积累，其中蓝光有利于虎杖愈伤组织中白藜芦醇的合成，而绿光不利于白藜芦醇的合成。

2.1.3 LED光质对虎杖愈伤组织中白藜芦醇总量的影响

不同光质条件下愈伤组织中白藜芦醇的总量都是在培养24 d时达到最大，且蓝光下白藜芦醇的总量明显高于其他光质条件，而红光下白藜芦醇的总量最低（图5）。由此可见，蓝光利于虎杖愈伤组织中白藜芦醇的积累， 而红光不利于虎杖愈伤组织中白藜芦醇的积累。

2.2 光照强度对虎杖愈伤组织增殖及其白藜芦醇积累的影响

2.2.1 光照强度对虎杖愈伤组织增殖的影响

光照强度对虎杖愈伤组织增殖有影响，不同光照强度对虎杖愈伤组织增殖的效果依次为弱>中>强（图6）。由此可见，弱光有利于虎杖愈伤组织的增殖，强光不利于虎杖愈伤组织的增殖。

2.2.2 光照强度对虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的影响

光照强度对虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量有影响，培养12 d以前強光下愈伤组织中白藜芦醇的含量最高，而18 d以后中等强度条件下的白藜芦醇含量最高（图7）。由此可见，强光适合于短期处理，而中强光适合于长期培养用。

2.2.3 光照强度对虎杖愈伤组织中白藜芦醇总量的影响

弱光和中强光下白藜芦醇的总量差别不大，在培养的前12 d强光下白藜芦醇的总量略高，而18 d以后则明显低于弱光和中强光（图8）。由此可见，弱光和中强光适于长期培养下虎杖愈伤组织中白藜芦醇的积累。

2.3 外植体来源对虎杖愈伤组织增殖及其白藜芦醇积累的影响

2.3.1 外植体来源对虎杖愈伤组织增殖的影响

外植体来源对虎杖愈伤组织增殖有影响，由茎段作为外植体诱导的愈伤组织增殖效果最好，而由叶片和叶柄作为外植体诱导的愈伤组织增殖效果相近，叶柄略优于叶片（图9）。由此可见，以茎段作为外植体利于虎杖愈伤组织的增殖。

2.3.2 外植体来源对虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的影响

外植体来源对虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量有影响，以叶片、茎段、叶柄作为外植体来源的虎杖愈伤组织中白藜芦醇的含量依次为茎段>叶片>叶柄，且以茎段作外植体诱导的愈伤组织中白藜芦醇含量明显高于叶片和叶柄（图10）。因而，以茎段作为外植体有利于虎杖愈伤组织中白藜芦醇的合成。

2.3.3 外植体来源对虎杖愈伤组织中白藜芦醇总量的影响

外植体来源对虎杖愈伤组织中白藜芦醇总量有影响，以茎段作为外植体的愈伤组织中白藜芦醇的总量明显高于叶片和叶柄（图11）。由此可见，以茎段作为外植体利于虎杖愈伤组织中白藜芦醇的积累。

3 讨论

在组织培养中，光是影响植物愈伤组织生长和内部生理生化反应进程的重要环境因子[5-6]。光对不同植物愈伤组织生长及其次生代谢产物的积累有不同的效应。外植体来源也是影响植物愈伤组织增殖和次生代谢产物积累的一个重要因素。本试验结果表明，光质和光照强度对虎杖愈伤组织生长及其白藜芦醇的积累有明显影响。不同光质条件下虎杖愈伤组织的增殖效果为绿光、黄光>蓝光>红光、白光>黑暗，说明光照有利于虎杖愈伤组织的增殖，黄光和绿光有利于虎杖愈伤组织的生长。但绿光不利于白藜芦醇的积累，而蓝光下白藜芦醇的积累量明显高于其他光质，是最适于虎杖愈伤组织白藜芦醇积累的光质条件。弱光有利于虎杖愈伤组织的增殖，强光短期处理能明显提高白藜芦醇的含量，但长期培养条件下，弱光和中强光比强光更利于白藜芦醇的积累。以茎段作为外植体，无论是愈伤组织增殖速度还是白藜芦醇的积累量都要明显高于叶片和叶柄。罗丽媛等研究了LED不同光质对葡萄愈伤组织及白藜芦醇合成的影响，发现绿光最有利于葡萄愈伤组织的生长，但抑制白藜芦醇的合成；蓝光对愈伤组织生长无明显影响，但能明显促进白藜芦醇含量和产量的提高；红光不利于自藜芦醇的积累[7]，本试验研究结果与其一致。周华等研究了不同波长LED光源对生菜生长和品质的影响，也发现蓝光能提高生菜的维生素C 和粗蛋白质含量[8]。赵德修等对水母雪莲愈伤组织的培养中也发现蓝光能显著提高黄酮的合成[9]。文涛等以虎杖茎段、叶片为外植体，研究了不同光照强度对虎杖愈伤组织的影响，也发现适当的光照强度能促进虎杖愈伤组织中白藜芦醇的合成；且以茎段作为外植体，虎杖愈伤组织的生物量和白藜芦醇含量也是明显高于叶片作为外植体[10]。尹明华也发现蓝光有利于江西铅山红芽芋试管苗可溶性总糖含量和可溶性蛋白质含量的增加[11]。但也有一些研究者在对不同植物组织培养的试验中，得出了不同的结论，如张真等认为黄光最有利于葡萄愈伤组织的增殖，而白光最有利于白藜芦醇的积累[12]；刘浩等发现LED 红光下愈伤组织的增殖倍数和萝卜硫素含量均为最高[13]；申海进等研究了滤光膜处理对花期野菊光合特性和叶绿素荧光的影响，发现红膜下类胡萝卜素含量最高[14]；吴祝华等发现红光下非洲菊产花状况最好[15]。导致研究结果不一致的原因可能有：不同的植物生长、发育受光的调节作用不同；培养基的成分和光照的波长及辐照等不同也会影响光照对植物组织培养物生长和发育的效应[16]。由此可见，光形态建成的复杂性，需要进行更深入的研究。

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