红景天苷对野百合碱诱导肺动脉高压大鼠Nrf-2及NF-κB信号通路的影响*

薛运昕,宁 欣,倪 楠, 郭天聪,蔡昕姝

辽宁省金秋医院呼吸科(沈阳110016)

红景天苷对野百合碱诱导肺动脉高压大鼠Nrf-2及NF-κB信号通路的影响*

薛运昕,宁 欣,倪 楠, 郭天聪,蔡昕姝

辽宁省金秋医院呼吸科(沈阳110016)

目的：探讨红景天苷对肺动脉高压大鼠的肺组织病理与Nrf-2及NF-κB信号通路的影响。方法：将6～8周龄雄性SD大鼠随机分为五组，每组6只。正常对照组注射对照溶剂，模型对照组及药物干预组(低、中、高)皮下注射60 mg/kg野百合碱后，于2～28 d后分别给予低、中、高浓度组注射50、100、200 mg/(kg·d)红景天苷，其余组别分别注射生理盐水；实验结束后，分别检测各组大鼠右心室收缩压(RVSP)及右心室肥厚指数；组织病理学检测大鼠肺组织细小动脉病理变化，RT-PCR检测肺组织HO-1 、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平，Western blot检测肺组织核蛋白Nrf-2、NF-κB p65 蛋白表达水平。结果：与正常对照组比较，模型对照组RVSP及右心室肥厚指数显著上升，肺组织表现明显炎症浸润，肺组织核蛋白Nrf-2及NF-κB均出现上调，HO-1 及TNF-α、IL-6 mRNA表达上调(P<0.05)；经过不同浓度红景天苷干预后，各组大鼠RVSP及右心室肥厚指数出现变化，高浓度组显著下调(P<0.05)；Nrf-2核蛋白水平及HO-1 mRNA表达进一步上升，NF-κB p65水平及TNF- α、IL-6 mRNA表达逐渐下调，呈浓度依赖(P<0.05)。结论：红景天苷能够减缓野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压，可能与Nrf-2活化以及抑制NF-κB信号通路有关。

肺动脉高压(Pulmonary artery hypertension，PAH)是一类由于肺动脉血压升高、右心室衰竭为特征的病理生理过程，主要表现为肺动脉血管内皮细胞受损、平滑肌细胞异常增殖以及肺血管重构，确切发病机制目前尚未完全阐明[1]。近年来研究表明，氧化应激可能参与了PAH过程中的肺血管重构[2]。核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2)是一种氧化应激重要的转录激活因子，参与体内氧化应激反应[3]；核因子-kappa B(Nuclear factor -kappa B，NF-κB)也参与了氧化应激以及炎症反应的调控过程，并可能与Nrf-2信号通路存在相互拮抗作用[4]。红景天苷是草本植物中药红景天的主要成分之一，部分研究表明红景天具有抗氧化应激、抗衰老、抗辐射、抗缺氧、抗肿瘤、抗病毒、保护心脑血管等疾病的作用。红景天苷能够抑制百草枯诱导PC12细胞的红细胞毒性，恢复了乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX-PX)的表达和活力，提示红景天苷可能是通过氧化应激酶发挥神经保护作用[5]。但关于红景天对于PAH的干预效果还少见报道。为此我们通过建立野百合碱诱导的PAH大鼠模型，观察红景天苷对大鼠肺组织病理以及Nrf-2/NF-κB信号通路的影响。

材料及方法

1 主要材料及试剂 6～8周龄雄性SD大鼠；野百合碱、红景天苷均购自大连美仑；M-MLV反转录酶、高纯总RNA快速提取试剂盒购自Bioteke(北京)；抗Nrf2、NFκ-B p65兔多克隆抗体购自万类生物(沈阳)；抗LaminA小鼠多克隆抗体购自Abcam(英国)；羊抗兔及羊抗小鼠辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗购自碧云天(海门)；细胞核蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒购自万类生物(沈阳)；生物机能实验系统(成都泰盟)。

2 动物建模及分组 将SD大鼠随机分为如下五组：正常对照组，模型对照组，低浓度组、中浓度组、高浓度组，每组6只；其中，正常对照注射等量溶剂(无水乙醇与生理盐水以2∶8稀释)，模型及药物处理组大鼠皮下注射60 mg/kg 野百合碱(溶于生理盐水稀释的无水乙醇中)。低浓度组、中浓度组、高浓度组在注射野百合碱第2～28天继续腹腔注射低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)浓度红景天苷干预，其他组注射等体积生理盐水。第28天，检测大鼠血流动力学指标，处死所有大鼠并取材，部分固定于4%多聚甲醛溶液中，部分液氮速冻转至-70℃冰箱中保存。

3 血流动力学检测 实验结束后，各组大鼠经腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉后，分别仰卧位固定于手术台上，将颈部去毛并消毒，利用手术剪剪开皮肤，使右侧颈外静脉分离，经颈外静脉插管至右心室，接通压力换能器并连接生物机能实验系统，记录大鼠右心室收缩压(RVSP)。

4 组织病理学观察 大鼠测压后将其处死，开胸取出心脏，切除左右心房及大血管，进一步分离右心室游离壁组织(RV)以及左心室和室间隔组织(LV+S)，仔细冲洗去除残留血栓，并用滤纸吸净表面水分，称重并计算右心室肥厚指数[RV/(LV+S)]；分离气管并结扎左肺叶，多聚甲醛灌注右肺进行固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，观察肺组织细小动脉病理改变情况。

5 RT-PCR检测肺组织HO-1、TNF-α及IL-6 mRNA表达 收集各组大鼠肺组织样本，参照总RNA提取试剂盒说明书提取大鼠肺组织RNA样本，并利用M-MLV逆转录酶反应合成cDNA第一链模板，加入相应检测引物进行PCR检测肺组织HO-1 、TNF-α、IL-6基因mRNA表达水平，根据NCBI数据库提供的目标基因序列信息，HO-1上游引物序列：5’- CTGGAATGGAAGGAGATGCC -3’，下游引物序列：5’- TCAGAACAGC CGCCTCTACCG -3’，片段长度132 bp； TNF α上游引物序列：5’- GCCACCACGCTCTTCTGTC -3’；下游引物序列： 5’- GCTACGGGCTTGT CACTCG -3’， 片段长度149 bp； IL6上游引物序列：5’- AGTTGTGCAATGGC AATTCTG -3’，下游引物序列： 5’- ATGACTCTGGCTT TGTCTTTC -3’， 片段长度223bp；内参为β-actin上游引物序列： 5’- GGAGATTACTGCCCTGGCC CTAGC -3’；下游引物序列： 5’-GGCCGGACTCATCGT ACTCCTGCTT -3’， 片段长度155 bp；PCR反应条件如下：95℃预变性5 min；95℃变性40 s；56℃退火40 s；72℃延伸30 s；30次扩增循环，72 ℃终末延伸3 min。吸取5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析扫描光密度数值，以β-actin为内参照，计算HO-1 、TNF- α、IL-6 基因mRNA的相对表达量。

6 Western blot检测肺组织核蛋白中Nrf-2、NF-κB p65的表达水平 对各组大鼠肺组织样本利用细胞核蛋白提取试剂盒匀浆裂解，提取核蛋白，BCA蛋白浓度检测试剂盒进行蛋白定量，并调整蛋白浓度，每组样本以20 μl进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转法低温转印，一抗(Nrf2、NF-κB P65均1∶500稀释)4℃孵育过夜，TBST充分洗涤，加入HRP标记羊抗兔二抗(1∶5000稀释)于37 ℃孵育45 min，经TBST充分洗涤，洒入ECL发光液适量，反应约5 min，放于暗室中对胶片进行曝光、显影、定影，扫描胶片采集灰度值，以β-actin做为内参进行校正，以正常对照组条带灰度值为1，其他组别条带灰度值与之进行比较，所得数值即为目标蛋白相对表达量。

结 果

1 右心室收缩压(RVSP)及右心室肥厚指数变化 与正常对照组比较，造模28 d后，模型对照组RVSP明显升高，提示造模成功；不同浓度梯度红景天苷干预后，中、低浓度组大鼠RVSP变化并不明显，但高浓度组降低程度显著，与模型组比较存在统计学差异(P<0.05)；正常对照组及模型对照组大鼠RV/(LV+S)分别为(0.23±0.07)及(0.44±0.10)，存在统计学差异(P<0.05)，不同浓度梯度红景天苷干预后，中、低浓度组大鼠RV/(LV+S)变化并不明显，但高浓度组降低程度显著，与模型组比较存在统计学意义(P<0.05)，见表1。

2 大鼠肺组织病理学变化 正常对照组大鼠细小肺动脉内膜结构平滑完整， 平滑肌层无增厚现象，细胞与胞核排列规则，无炎症细胞浸润；而模型对照组大鼠肺组织炎性细胞浸润明显，血管周围存在大量淋巴细胞与中性粒细胞，平滑肌全层增厚，细胞排列紊乱；不同浓度梯度红景天苷干预后，各组大鼠肺组织炎性细胞浸润程度逐渐减弱，肺细小血管重塑情况得到改善，高浓度组变化最为明显(图1)。

表1 各组大鼠血流动力学及病理学指标比较

注：与正常对照组比较,*P<0.05；与模型对照组比较,∆P<0.05

A：正常对照组；B：模型对照组；C：低浓度组；D：中浓度组；E：高浓度组

3 RT-PCR检测肺组织HO-1 、TNF-α、IL-6 mRNA表达 与正常对照组比较，模型对照组大鼠肺组织HO-1 、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平显著上调(P<0.05)；不同浓度梯度红景天苷干预后，各组大鼠肺组织HO-1 、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平逐渐降低，与模型对照组比较具有统计学意义(P<0.05)(图2)。

A：RT-PCR检测肺组织HO-1 、TNF-α、IL-6 mRNA表达；B：肺组织HO-1 、TNF-α、IL-6 mRNA相对表达量；a：与正常对照组比较， P<0.05；b:与模型对照组比较， P<0.05

4 Western blot检测肺组织Nrf-2、NF-κB p65在核蛋白中的表达水平 与正常对照组比较，模型对照组大鼠肺组织核蛋白中Nrf-2表达水平有所上升，而NF-κB p65表达显著上调(P<0.05)；不同浓度梯度红景天苷干预后，各组大鼠肺组织核蛋白中Nrf-2表达水平进一步上升，而NF-κB p65水平逐渐下降，呈浓度梯度依赖，与模型对照组比较具有统计学意义(P<0.05)(图3)。

A：Western blot检测肺组织核蛋白中Nrf-2、NF-κB p65蛋白表达情况；B：肺组织核蛋白中Nrf-2、NF-κB p65相对表达量；a:与正常对照组比较， P<0.05；b:与模型对照组比较， P<0.05

讨 论

PAH是一种血管重构性疾病，近年来发病趋于老龄化，病死率居高不下[6]。平滑肌细胞与内皮细胞增殖分化是PAH发生的主要病理基础，氧化应激在肺动脉内皮细胞损伤及平滑肌细胞增殖活化过程的作用逐渐引起重视[7]。红景天苷是藏药红景天的主要有效成分，具有保护心脑血管系统，抗疲劳、抗肿瘤等多重药理作用，具有较为广泛的应用前景[8]。

大量的动物实验结果表明，引起血管重塑的主要因素包括炎症、剪切应力以及低氧，上述因素均能够导致活性氧(ROS)增加，NF-κB作为重要的炎症介质转录调节因子，而Nrf-2是细胞防御多种氧化应激损伤的核心转录调节因子，具有抗炎症、抗氧化损伤等作用，能够拮抗NF-κB活性[9]。

缺氧性肺动脉高压是众多心肺疾病发生发展的重要环节，已有研究表明，与正常人比较，严重肺动脉高压患者肺组织中血红素氧合酶-1(HO-1)表达明显降低，上调HO-1有助于减缓肺动脉高压的进展[10]。Ping Z等指出红景天苷能够通过增强Nrf-1/Nrf-2信号及线粒体呼吸功能改善过度运动引起的心肌细胞损伤[11]。本实验中，与正常对照大鼠相比，在模型对照组大鼠中，RVSP及右心室肥厚指数显著增加，提示造模成功；肺组织核蛋白NF-κB p65的水平显著上升，同时其下游靶基因TNF- α、IL-6 mRNA表达明显上调，提示大鼠肺组织中炎症反应激活，组织病理学染色结果显示模型对照组肺组织炎性细胞浸润明显，平滑肌层增厚，细胞及胞核排列紊乱，也印证了这一点； 与此同时，Nrf-2在核蛋白中的水平出现上调，推测大鼠肺组织的氧化应激与炎症反应引起了机体的保护性应激反应，刺激了Nrf-2的活化，引起其下游靶基因HO-1 mRNA表达上升；给予红景天苷干预后，各组大鼠Nrf-2及HO-1水平继续上调， NF-κB在核蛋白水平降低，活化受到抑制，从而抑制炎症因子TNF-α、IL-6的转录，并呈浓度梯度依赖。提示红景天苷干预下，Nrf-2活性进一步激活，调控HO-1表达升高，启动机体抗炎抗氧化反应，并拮抗NF-κB信号通路，抑制其下游靶基因TNF-α、IL-6等表达，调控炎症反应及氧化应激。

本研究结果证明，红景天苷具有抗炎及抗氧化功能，对野百合碱诱导的PAH大鼠模型具有一定的抑制或缓解作用，能够促进PAH模型中Nrf-2的活化，进而激活其信号通路，抑制NF-κB的活性及其下游炎症因子的表达，在一定程度上能够改善PAH大鼠肺组织临床病理形态变化。

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(收稿：2016-08-18)

Effect of Salidroside on the Nrf-2 and NF-κB signal pathway in monocrotaline -induced pulmonary hypertension in rats

Xue Yunxin,Nin Xin,Ni Nan,et al. Jin Qiu Hospital of Liaoning Province(Shenyang110016)

Objective: To investigate the effect of salidroside on Nrf-2/NFκB signaling pathway on lung tissue pathology in rats with pulmonary hypertension.Methods: 6-8 week male SD rats were randomly divided into 5 groups, with 6 rats in each group. Normal control group was injected with control solvent, model control group and drug intervention group (low, middle, high) subcutaneous injection of 60 mg/kg monocrotaline. The low, medium and high concentration groups were given 50, 100 and 200 mg/(kg·d) of salidroside in 2-28 day. The other groups were injected with normal saline. At the end of the experiment, the right ventricular systolic pressure (RVSP) and the right ventricular hypertrophy index were detected in each group. Histopathological examination of the pathological changes of pulmonary tissue in rats. The mRNA expression level of HO-1,TNF-α,and IL-6 in lung tissue was detected by RT-PCR. The protein expression level of Nrf-2 and NF-κB p65 in lung tissue nuclear protein was detected by Western blot. Results: Compared with the normal control group, the RVSP and the right ventricular hypertrophy index of the model group increased significantly, and the lung tissue showed significant inflammatory infiltration. The expression of Nrf-2 and NF-κB in lung tissue nuclear protein was up-regulated, and the expression of HO-1, TNF, and IL6 mRNA was up-regulated (P< 0.05). After treatment with different concentrations of salidroside, RVSP and right ventricular hypertrophy index began to change, and which in the high concentration group was significantly decreased (P< 0.05). The level of Nrf-2 protein and the expression of HO-1 mRNA were further increased, the levels of NF-κB p65 and the expression of TNF-α and IL-6 mRNA were decreased gradually, and showed a concentration dependence (P< 0.05).Conclusion: Salidroside may alleviate the pulmonary hypertension induced by monocrotaline, which may be related to the activation of Nrf-2 and the inhibition of NF-κB signaling pathway.

Pulmonary hypertension/physiopatology Rhodioloside/pharmcology Activating transcription factors Nuclear factor -kappa B Monocrotaline Rats

*辽宁省直医院改革重点临床科室诊断能力建设项目青年项目(LNCCC-D37-2015)

肺动脉高压/病理生理学 红景天苷/药理学 转录激活因子 核因子-kappa B 野百合碱 大鼠

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.03.004