溃疡性结肠炎中Gal-3与BCL-2表达的意义

钟文洲，林松挺，陈正义，黄晓曦

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)为肠道慢性非特异性炎症疾病，其病变大多局限于结直肠黏膜及黏膜下层，病变部位多发生在直肠和乙状结肠，甚至包括整个结肠，然而临床对其病因尚不明确，国外相关研究认为细胞凋亡对UC的免疫功能影响极大[1]。B淋巴细胞瘤-2基因(B cell leukemia/lymphoma-2, BCL-2)作为细胞凋亡抑制基因，其功能为抑制细胞正常凋亡。半乳糖凝集素3(Galectin-3, Gal-3)为糖粘合蛋白，其不仅与调节细胞的增殖、凋亡、黏附和迁移等细胞活动有关，还参与免疫调节、肿瘤发生和转移等生理和病理活动[2]。BCL-2和Gal-3在结构上相似，本实验探讨两者在UC患者结直肠黏膜组织中表达及与UC发病的关系。

1 材料与方法

1.1一般资料选取海南省海口市人民医院消化内科2014年8月～2015年12月消化科住院部及门诊确诊为UC的患者64例，其中男性41例，女性23例，年龄23～78岁，平均(42.3±12.1)岁，设为观察组。另选取健康志愿者50例作为对照组，其中男性31例，女性19例，年龄21～75岁，平均(41.1±11.7)岁。两组患者年龄、性别分布差异无统计学意义。根据Riley分级[3]：Ⅰ级为黏膜充血，黏膜下血管网模糊并有淤血，Ⅱ级在Ⅰ级的基础上充血更加明显，并复加小溃疡及黏膜颗粒，Ⅲ级在Ⅱ级的基础上颗粒更为明显，并添加自发性出血，小溃疡融合及出血脓性渗出物。观察组中Ⅰ级28例，Ⅱ级21例，Ⅲ级15例。本实验经院伦理协会批准，所有实验患者均自愿签署知情同意书。

1.2试剂与器械兔抗人Gal-3、BCL-2多克隆抗体(ABGENT公司，美国)，辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗兔IgG(H+L)(Jackson Immunoresearch公司，美国)，恒温箱(北京中仪万成科技公司)。

1.3方法

1.3.1免疫组化 采用免疫组化SP法检测BCL-2和Gal-3的表达，一抗为兔抗人Gal-3或BCL-2多克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗兔IgG(H+L)。将石蜡切片进行常规脱水及水化，第1次PBS冲洗后，灭活内源性过氧化物酶，通过高温高压修复抗原，第2次进行PBS冲洗。将兔抗人Gal-3 2 000倍稀释或BCL-2多克隆抗体100倍稀释，将一抗加入冲洗好的石蜡液内，放进恒温箱内孵育2 h，第3次进行PBS冲洗，加入二抗，放进恒温箱内孵育30 min，第4次进行PBS冲洗，DAB显色，第5次进行PBS冲洗，使用苏木精进行复染，待返蓝、脱水、烤干后封片。将PBS设置为一抗代替物作为阴性对照，设置空白对照组[4]。

1.3.2判断标准 使用光镜进行观察，通过观察染色程度进行阳性判断，无阳性着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分[5]。以细胞质或细胞核出现明显黄色颗粒为阳性。同时可通过显微细胞计数检测着色细胞比例：无阳性细胞为0分，1%～10%为1分，10%～50%为2分，50%～75%为3分，75%～100%为4分。将两项得分结果相乘：≥3分为阳性，<3分为阴性[6]。

2 结果

2.1UC和正常结直肠黏膜上皮细胞中BCL-2和Gal-3的表达Gal-3表达于结直肠黏膜上皮细胞的细胞质，呈棕黄色，其在正常结直肠黏膜上皮细胞的细胞质表达水平较高，分布均匀，在UC结直肠黏膜上皮细胞的细胞质中表达水平较低，且分布不均，呈斑点状(图1、2)。BCL-2表达于结直肠黏膜上皮细胞的细胞质，呈棕黄色颗粒，其在正常结直肠黏膜上皮细胞的细胞质表达水平较低，表达主要区域为结肠隐窝基底部，在UC结直肠黏膜上皮细胞细胞质中的表达水平较高，表达强烈的细胞主要为淋巴细胞、中性粒细胞和浆细胞(图3、4)。对照组的Gal-3阳性率为100%，高于观察组的37.5%(χ2=48.142，P<0.001)；对照组的BCL-2阳性率为20%，低于观察组的90.62%(χ2=58.171，P<0.001，表1)。

表1 溃疡性结肠炎和正常结直肠黏膜上皮细胞中BCL-2和Gal-3表达[n(%)]

①②③④

图1Gal-3在正常结直肠黏膜上皮细胞中的表达，SP法
图2Gal-3在溃疡性结肠炎结直肠黏膜上皮细胞中的表达，SP法
图3BCL-2在正常结直肠黏膜上皮细胞中的表达，SP法
图4BCL-2在溃疡性结肠炎结直肠黏膜上皮细胞中的表达，SP法

2.2不同内镜分级UC患者BCL-2和Gal-3的表达水平UC Ⅰ级与Ⅱ级Gal-3阳性率的比较，差异无统计学意义(χ2=3.600，P=0.058)；UC Ⅰ级Gal-3阳性率高于UC Ⅲ级(χ2=4.532，P=0.033)；UC Ⅲ级与Ⅱ级Gal-3阳性率差异无统计学意义(χ2=0.183，P=0.669)；UC Ⅰ级BCL-2阳性率低于UC Ⅱ级(χ2=5.539，P=0.019)；UC Ⅰ级BCL-2阳性率低于UC Ⅲ级(χ2=6.098，P=0.014)；UC Ⅲ级与Ⅱ级BCL-2阳性率差异无统计学意义(χ2=0.511，P=0.475，表2)。

表2 不同内镜分级溃疡性结肠炎的BCL-2和Gal-3阳性率比较[n(%)]

2.3BCL-2和Gal-3表达与UC患者临床特征的关系BCL-2和Gal-3表达与UC患者性别、年龄及病程均无关(P>0.05，表3)。

表3 BCL-2和Gal-3表达与溃疡性结肠炎患者临床特征的关系[n(%)]

2.4UC结直肠黏膜组织中BCL-2和Gal-3表达的相关性UC结直肠黏膜组织中BCL-2和Gal-3表达阳性者23例，占组内35.94%，Person相关分析显示，两者表达无相关性(r=0.03，P>0.05)。

3 讨论

UC临床表现为腹部瘀结形成包块，结直肠长期受到挤压，本质上为一种占位性病变[7]。结节的长期占位严重影响结直肠正常蠕动和血液供给，因此失去免疫能力，极易引发感染。结直肠被感染后出现肠黏膜充血，纹理模糊，形成结肠炎。由于长期不愈，肠绒毛糜烂溃疡，形成板结性结节硬块，从而引发全结肠溃疡[8]。但目前对其发病因素尚未明确，BCL-2和Gal-3的结构相似，且两者均在结直肠黏膜上皮细胞的细胞质中表达，所以本实验通过探讨两者在UC结直肠黏膜组织中的表达水平，并探讨两者与UC发病的关联性。

本组实验发现，UC结直肠黏膜组织中Gal-3阳性率高于正常黏膜组织；UC结直肠黏膜组织中BCL-2阳性率为低于正常黏膜组织。表明BCL-2和Gal-3在UC结直肠黏膜组织中的表达显著异于正常结直肠黏膜组织。同时得出Gal-3在正常结直肠黏膜组织表达较为强烈，而在UC结直肠黏膜中的表达则显著减弱。UC Ⅰ级Gal-3、BCL-2阳性率与UC Ⅱ级的差异无统计学意义，与UC Ⅲ级的差异有统计学意义，而UC Ⅱ级的Gal-3、BCL-2阳性率与UC Ⅲ级的差异无统计学意义。表明Gal-3和BCL-2在UC结直肠黏膜组织中的表达受病变程度影响，且UCⅠ级Gal-3表达水平高，而在Ⅱ级和Ⅲ级表达水平较低。并且，BCL-2表达水平与Gal-3相反，随着病变程度的加深而增高。既往文献表明，BCL-2在UC结直肠黏膜组织中的表达增高为炎症反应的反应性增生，推断与隐窝上皮细胞再生修复有关[9]。此外，本组实验发现，BCL-2和Gal-3的表达与患者性别、年龄及病程均无关，同时两者在UC结直肠黏膜组织中的表达并无关联性。结果进一步证明BCL-2和Gal-3表达只与病程相关，同时两者间并无相互影响。然而国内研究发现，BCL-2和Gal-3在UC结直肠黏膜中的表达呈协同作用，两者具备相关性[10]，与本文实验结果不一致，日后应进行更多实验进行验证。

Gal-3是一类糖粘合蛋白家族，具有多种生物学行为。Gal-3常以同二聚体的形式存在，主要存在于细胞质中，细胞核和细胞表面也有表达[11]。外源性Gal-3可刺激成纤维细胞、肾小球细胞和平滑肌细胞生长；内源性Gal-3在细胞生长中起作用。通过转染Gal-3反义寡核苷酸或者反义cDNA而使细胞系Gal-3表达受抑制[12]。既往研究表明，Gal-3存在抗凋亡作用，其表达水平增高有利于细胞抵抗由各种因素介导的细胞凋亡，并在凋亡刺激物的作用下,其能转移到核周膜，且浓缩于线粒体内，抑制细胞色素C释放和防止线粒体遭受破坏[13]。此外Gal-3具备抗炎作用及介导细胞黏附作用[14]。BCL-2位于人体内18号染色体，易位于14号染色体。BCL-2是目前发现的与凋亡关系密切的原癌基因之一，能够编码BCL-2α和BCL-2β两种蛋白质，主要存在于线粒体外膜、核膜及部分内质网中[15]。BCL-2可抑制细胞凋亡，从而延长细胞生存时间，正常结肠上皮组织发生凋亡的主要场所在隐窝和绒毛顶部，可通过清除衰老细胞，控制总体细胞数量，从而保持上皮组织的完整性。在炎性状态下，细胞较正常情况下处于高激活状态，更容易凋亡，故BCL-2在炎性组织中表达水平较高[16]。

溃疡性结肠炎病因尚未明确，但临床目前存在以下4个看法[17]：(1)感染学说：因本病的病理变化和临床表现与细菌痢疾非常相似，相关研究从患者粪便中提取出细菌并发现可用抗生素治疗；(2)免疫学说：认为自身免疫介导的组织损伤是溃疡性结肠炎发病的重要因素，相关研究发现肠壁病原体与人体结直肠上皮细胞存在交叉感染，从而引发机体免疫作用杀伤自身上皮细胞；(3)遗传学说：国外数据表明白种人的UC发病率较黑种人显著提高；(4)精神因素，认为精神障碍引起自主神经功能失调，导致肠壁炎症及溃疡形成。

综上所述，BCL-2在UC结直肠黏膜组织中的表达水平高于正常结直肠黏膜组织，Gal-3表达水平低于正常结直肠黏膜组织，表达受UC内镜分级影响，但与患者性别、年龄及病程均无关。Gal-3和BCL-2在UC发病中可起到独立作用。

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