甾体类化合物免疫抑制毒性体外筛选终点指标的选择研究

宋秀春⋆，吕金艳

（呼伦贝尔市人民医院体检科，内蒙古 呼伦贝尔 021008）

地塞米松是一种具有强免疫抑制作用的糖皮质激素类化合物，广泛用于各种炎症性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病及器官移植排斥的治疗。在药物开发中，地塞米松被作为免疫调节药物研究的阳性药[1-3]。

经过长期研究，地塞米松对于各种免疫细胞的调节作用已经积累大量数据，其中地塞米松对于CD4+T细胞活化、增殖和分化的抑制作用也是很明确的。然而，地塞米松对于CD4+T细胞活化标志物的调节作用研究不够明确，特别是对于CD69的表达调节作用还存在矛盾的结果。因此，进一步研究地塞米松对于CD4+T细胞活化标志物的调节作用，对于利用流式细胞术研究免疫调节药物对于CD4+T细胞活化具有重要意义。本研究将利用流式细胞术分析地塞米松对于CD4+T细胞活化标志物CD69和CD25的调节作用

1 仪器与材料

1.1 仪器

流式细胞仪：购自BDBiosciences公司（FACSCantoTMⅡ）。

1.2 动物

8周龄雄性Balb/c小鼠，购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.3 试剂

仓鼠抗小鼠CD3e和CD28抗体（货号：BR31101和BR31103），购自北京佰瑞达生物科技有限公司；大鼠抗小鼠单克隆抗体FITC-CD69、PECD25和PE-CY7-CD4 （货号：553237、558642、552775），购自BD Biosciences公司；地塞米松（货号：D1756），购自Sigma-Aldrich公司。

2 方 法

2.1 小鼠脾脏白细胞制备

无菌取小鼠脾脏放入70 μM无菌滤网中，用5 mL注射器内芯研磨，并用20 mL的PBS冲洗，获得小鼠脾脏细胞悬液；然后200 g离心5分钟，弃上清，加入10 mL红细胞裂解液裂解红细胞，然后加入20 mL RPMI1640培养基终止裂解，200 g离心5分钟，弃上清；再利用10 mL的含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞，然后200 g离心5分钟，弃上清；最后再利用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞（含氨苄青霉素和链霉素），并通过细胞计数将细胞浓度稀释到1×107个/mL。

2.2 流式细胞术测定CD4+ T细胞活化标志物

利用PBS稀释大鼠抗小鼠CD3e抗体到2 μg/mL，加入24孔板，每孔250 μL，4℃包被过夜；将小鼠脾脏白细胞接种到未包被抗体24孔板中，1×106个/孔，作为对照组，将细胞接种到包被抗体的24孔板中，作为模型组和地塞米松组，加入大鼠抗小鼠CD28抗体至终浓度为2 μg/mL；在地塞米松组加入地塞米松至终浓度为10 μM；37℃，5% CO2条件下继续培养24小时；然后收集细胞按说明书标记大鼠抗小鼠单克隆抗体FITC-CD69、PE-CD25和PE-CY7-CD4，利用流式细胞仪检测CD4+T细胞表面CD69和CD25的表达。

2.3 统计分析

数据资料均用平均值±标准差（M±SD）表示，所有实验均重复至少三次；利用GraphPad 5.0进行统计分析，Student’s t检验分析组间差异；P＜0.05被设定为具有统计学差异。利用Flowjo7.6.1处理流式细胞图。

3 结 果

3.1 地塞米松对CD4+ T细胞活化标志物CD69的调节作用

经流式细胞测定，CD4+T细胞受大鼠抗小鼠CD3e/CD28抗体刺激后，CD69的表达均显著上升，地塞米松对CD69表达上调无显著抑制作用（P＞0.05），如图1所示。

图1 地塞米松（DEX）对CD4+ T细胞活化标志物

CD69的调节作用测定。小鼠脾脏白细胞接种到包被大鼠抗小鼠CD3e抗体的24孔板中，加入或不加入地塞米松处理，再加入大鼠抗小鼠CD28抗体，培养24 h，利用流式细胞术测定CD4+T细胞表面CD69（A，B）表达。#P＜0.05 vs Control；*P＜0.05 vs Model。

3.2 地塞米松对CD4+ T细胞活化标志物CD25的调节作用

经流式细胞测定，CD4+T细胞受大鼠抗小鼠CD3e/CD28抗体刺激后，CD25的表达均显著上升，地塞米松对CD25表达上调具有显著抑制作用（P＜0.05），如图2所示。

图2：地塞米松（DEX）对CD4+ T细胞活化标志物

CD25的调节作用测定。小鼠脾脏白细胞接种到包被大鼠抗小鼠CD3e抗体的24孔板中，加入或不加入地塞米松处理，再加入大鼠抗小鼠CD28抗体，培养24 h，利用流式细胞术测定CD4+T细胞表面CD25（A，B）表达。#P＜0.05 vs Control；*P＜0.05 vs Model。

4 讨 论

CD4+T细胞是哺乳动物及人类发挥适应性免疫功能的重要细胞。CD4+T细胞又称为辅助型T细胞，在接受抗原提呈细胞MHCⅡ类分子提呈的抗原刺激及共刺激信号后迅速活化，细胞表面CD69，CD25等活化标志物迅速上调，利用流式细胞术可以方便地监测CD4+T细胞活化[4-7]。

本研究主要研究具有广谱免疫抑制作用阳性药地塞米松对CD4+T细胞活化标志物CD69和CD25的调节作用，从而为新型免疫抑制剂的免疫调节作用研究提供参考。研究结果表明地塞米松对CD4+T细胞表面CD69上调无抑制作用，而对CD25上调具有显著抑制作用；因此，如果利用流式细胞筛选免疫抑制剂，特别是甾体类化合物，适合选择CD25表达量为CD4+T细胞抑制作用的终点指标。

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