2010-2015年福建省乙型流感病毒血凝素基因特征分析

林丽华 谢剑锋 翁育伟 张炎华 赵琳 郑奎城

350001 福州, 福建省人兽共患病研究重点实验室 福建省疾病预防控制中心

·论著·

2010-2015年福建省乙型流感病毒血凝素基因特征分析

林丽华 谢剑锋 翁育伟 张炎华 赵琳 郑奎城

350001 福州, 福建省人兽共患病研究重点实验室 福建省疾病预防控制中心

林丽华、谢剑锋为共同第一作者

目的 了解2010-2015年福建省乙型流感病毒血凝素(HA)基因特征，明确流行株对疫苗的匹配情况。方法 从2010-2015年福建省流感网络实验室保存的乙型流感毒株中随机抽取B Victoria系和Yamagata系流感病毒，通过RT-PCR方法扩增HA基因，测序获得其全长序列，然后利用生物信息学软件分析HA基因特性。结果 与疫苗株相比，2010-2015年B Yamagata系流感病毒HA基因变异程度较大，主要有116、150、165、196和202这5个涉及抗原决定簇的氨基酸位点变异，且随时间的推移变异位点逐渐增多，尤以2010年、2014年和2015年变异较为明显；然而，Victoria系流感病毒HA基因的变异较小，且没有明显随时间累积的趋势。2010年和2015年两个年份WHO推荐的Yamagata系疫苗株对福建省的乙型流感保护效果不佳，其余年份的Yamagata系疫苗株对人群保护作用尚可，而Victoria系疫苗株仍具有较好的保护效果。结论 随着时间的推移，乙型流感病毒已经逐渐发生变异，部分年份的Yamagata系毒株与疫苗株的匹配效果不佳，且出现了抗原漂移现象。今后需进一步加强流感病毒基因监测，以及时发现新的变异株，为流感防控提供依据。

Fund programs: Natural Science Foundation of Fujian Province of China(2015J01294);Medical Innovation Foundation of Fujian Province (2014-CX-9);Youth Backbone Talents Cultivation Program of Health System in Fujian Province (2015-ZGN-ZD-10)

流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，是一种发病率高、传染性强、传播速度快的疾病。流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒属，根据内部核蛋白(NP)和基质蛋白(MP)的抗原性差异，可被分为甲(A)、乙(B)和丙(C)三个型别。乙型流感病毒是人类主要的流感病毒之一，常引起地区和季节性流行，根据抗原性和HA1区基因特性分为两大谱系，代表株分别为 B/Yamagata/16/88和B/Victoria/2/87，称为Yamagata系和Victoria系[1，2]。甲型流感常常会引起暴发流行，甚至导致世界大流行，所以甲型流感更引起人们的关注，也被更多的研究分析报道。然而，乙型流感病毒虽然未造成世界性的大流行，但常常在全球范围内引起局部暴发，一些监测和流行病学数据还显示乙型流感也能带来严重的疾病和经济负担，如2004年以来，乙型流感病毒占所有流行的流感病毒的1%-56%，并且导致1%-52%的流感相关的儿童死亡率[3]。

流感病毒的快速变异是流感在人群中不断流行和传播的重要原因，而表面抗原血凝素(HA)是抗原变异的分子基础。为了从分子水平上了解福建省乙型流感毒株HA基因的变异情况及与疫苗株的匹配性，本研究随机选取福建省2010-2015年的乙型流感毒株，对HA基因进行序列测定和分子特征分析，了解其变异特点及规律。通过与WHO推荐的疫苗株进行比较，分析福建省当前乙型流感流行株与疫苗株的匹配效果，为乙型流感的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 毒株来源 本次研究以2010-2015年福建省乙型流感毒株作为研究对象，按随机抽样抽取乙型流感两个种系(BV和BY)的毒株进行HA基因序列测定和分析。共计选取99株乙型流感病毒，其中2010年20株(BV11株、BY9株)、2011年19株(BV13株、BY6株)、2012年12株(BV6株、BY6株)、2013年12株(BV0株、BY12株)、2014年19株(BV5株、BY14株)、2015年17株(BV5株、BY12株)。

1.2 病毒RNA提取 采用德国Qiagen公司的RNA提取试剂盒，按照操作说明书提取病毒RNA，具体步骤参考产品说明书。

1.3 引物 RT-PCR扩增引物来自http://gsc.jcvi.org/projects/msc/influenza/网站，引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 RT-PCR扩增与测序 RT-PCR采用TaKaRa(大连宝生物有限公司)的PrimeScript One Step RT-PCR Kit试剂盒，反应体系参照试剂盒说明配置。一步法RT-PCR条件为：50℃ 30 min,94℃ 2 min,(94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min 50 s) 30 cycles,72℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察，产物量达50 ng/μl后，送至福州尚辰生物技术有限公司进行产物纯化和测序。

1.5 序列分析 测序产物采用DNAStar7.1和MEGA5.0对HA基因的序列进行拼接、比对，分析毒株序列之间、毒株序列与疫苗株序列之间氨基酸同源性及氨基酸位点变异情况。构建HA基因进化树采用邻位相临法(Neighbor-Joining)，重复值为1 000。利用N-糖基化位点在线预测软件NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)进行糖基化位点分析。

1.6 参考疫苗株 WHO推荐北半球乙型流感历年疫苗株：B/Florida/4/2006(2008-2011 Yamagata)，B/Wisconsin/01/2010(2012-2013 Yamagata)，B/Massachusetts/2/2012(2013-2015 Yamagata)，B/Brisbane/60/2008(2009-2015 Victoria)[4]。

2 结果

2.1 乙型流感病毒HA基因同源性分析 乙型流感Yamagata系和Victoria系病毒HA基因分别编码584个和585个氨基酸。WHO推荐了3株Yamagata系疫苗株和1株Victoria系疫苗株作为2008-2015年的乙型流感北半球疫苗株，本次研究分析的福建省乙型流感两个种系毒株与同期相应疫苗株HA基因相比，氨基酸同源性均≥96.1%(见表1)。

表1 2010-2015年福建省乙型流感毒株与同期 疫苗株HA基因氨基酸同源性比较

表2 2010-2015年福建省B Yamagata系流感病毒HA基因涉及抗原决定簇主要氨基酸位点变异情况

注：a、b、c和d分别表示抗原决定簇120环、150环、160环和190螺旋；★受体结合位点；﹟毒株数

Note: a, 120-loop; b, 150-loop; c, 160-loop; d, 190-helix; ★, the receptor binding sites (RBS); ﹟, the number of viral strains

2.2 乙型流感病毒HA基因进化分析 HA基因核苷酸进化分析显示，两个种系毒株在进化树上各形成两个主要分支(图1)。Yamagata系分为Y1和Y2两个分枝，Y1分枝的毒株与B/Wisconsin/01/2010疫苗株的亲缘关系更近，Y2分支的毒株与疫苗株B/Massachusetts/2/2012和B/Florida/4/2006的亲缘关系更近。其中，福建省2010年和2015年的全部毒株属于Y1分枝，2011-2012年的毒株主要分布在Y2分枝，2013-2014年的毒株则分散在Y1和Y2分枝中。Victoria系分成2010-2012年、2014-2015年两个主要分支，2010-2012年分支与疫苗株B/Brisbane/60/2008亲缘关系较近。

2.3 基因抗原性分析 在B Yamagata系流感毒株中， 相对于B/Florida/4/2006疫苗株，福建省2010年所有9个毒株和2011年的2个毒株(B/Fujian-yanping/2229/2011和B/Fujian-gulou/1553/2011)HA基因均出现S150I、N165Y、D196N和N202S的变异，并涉及3个抗原决定簇，抗原出现漂移现象。自2011年起，福建省B Yamagata系流感病毒均出现D196N变异，且同时具备N116K、S150I、N165Y、N202S氨基酸位点的逐渐累积变异，其涉及抗原决定簇的120环、150环、160环和190螺旋。直至2015年所有分析的毒株均发生上述位点变异，抗原出现漂移，致使B/Massachusetts/2/2012疫苗株已无法很好与当前流行株进行匹配。值得注意的是在2010-2015年中，毒株还出现150、165和202氨基酸位点回复突变情况。详见表2。

与Yamagata系流感毒株相比，Victoria系毒株HA基因的变异较小。相对于B/Brisbane/60/2008疫苗株，福建省2010-2015年B Victoria系流感毒株在HA基因抗原决定簇中均出现I146V变异，2011-2012年毒株主要出现N129S和N171D变异，2014-2015年毒株主要出现K209N的变异，余年份未见明显变异，未出现抗原漂移现象。

2.4 疫苗匹配性分析 从疫苗匹配效果来看，福建省2010年和2015年的B Yamagata系流感病毒相对疫苗株均出现≥4氨基酸位点变异，且涉及3个抗原决定簇。进一步分析比较毒株与下轮疫苗株氨基酸差异情况(见表3)，Yamagata系毒株与当前疫苗株在抗原决定区的氨基酸差异平均为3.1个，涉及的抗原决定簇数平均为2.9个；而与下轮疫苗株相比，抗原决定区的氨基酸差异平均为2.2个，涉及的抗原决定簇数平均为1.9个；除了2011年毒株与当前疫苗株匹配性较好外，其余年份的毒株均与下轮疫苗株的匹配性更好，且与下轮疫苗株相比毒株均未出现抗原漂移的现象，经t检验，差异有统计学意义(t=3.033，P<0.05)。

表3 B Yamagata毒株与疫苗株在抗原决定簇上的氨基酸差异(平均值)

注：①B/Florida/4/2006；②B/Wisconsin/01/2010；③B/Massachusetts/2/2012；④B/Phuket/3073/2013。“t”表示对“毒株与当前疫苗株”和“毒株与下轮疫苗株”在抗原决定区的差异进行t检验；“P<0.05”表示“毒株与当前疫苗株”和“毒株与下轮疫苗株”在抗原决定区的差异具有统计学意义

Note: ①B/Florida/4/200；②B/Wisconsin/01/2010；③B/Massachusetts/2/2012； ④B/Phuket/3073/2013. t, t-test of the different in antigenic sites between viral strains and current vaccines and next vaccines.P<0.05, indicating that the difference is statistically significant

Victoria系毒株与B/Brisbane/60/2008疫苗株在抗原决定簇上的氨基酸差异平均为1.8个，涉及的抗原决定簇平均数为1.7个，福建省近年来的Victoria系流感流行株与疫苗株匹配良好，表明该疫苗株对人群仍具有一定的保护效果。

图1 2010-2015年福建省乙型流感毒株Yamagata(A) and Victoria(B)HA基因核苷酸进化树Note：▲：Vaccine strainsFig.1 Phylogenetic tree of the HA gene of influenza B viruses Yamagata(A) and Victoria(B) in Fujian, 2010-2015

2.5 糖基化位点分析 与早期疫苗株B/Florida/4/2006相比，所有Yamagata系毒株均在HA蛋白196位上增加一个糖基化位点。同时，除B/Fujian-cangshan/1358/2010缺失530位外，其余毒株的HA蛋白上都有11个糖基化位点(25、59、145、167、196、303、332、491、517、530、562)；与疫苗株B/Brisbane/60/2008相比，Victoria系毒株中除B/Fujian-siming/1209/2010缺失563位、B/Fujian-xianyou/193/2010缺失197位、B/Fujian-gulou/1458/2010缺失197位、B/Fujian-meilie/1180/2011等7株毒株缺失531位外，其余毒株的HA蛋白上都有12个糖基化位点(25、59、145、166、197、233、304、333、492、518、531、563)。

3 讨论

随着时间的推移，近6年来福建省B Yamagata系毒株变异位点逐渐增多，相对当前疫苗株尤以2010年、2014年和2015年变异较为明显。在所有的突变位点中，部分位点的突变得以延续，而部分位点经过若干年后发生回复突变。延续下来的突变能使病毒获得较强的适应性利于病毒的存活，未延续下来的突变属于非适应性突变，无法承受自然选择的压力不利于病毒存活而被淘汰。而Victoria系毒株在HA基因上的变异较小，且没有随时间变化逐渐累积的趋势，体现了病毒在自然选择的压力下通过不断调整自身以获得更强的适应性。

流感疫苗对人群的保护效果取决于流行株与疫苗株的匹配状况。研究表明，HA基因的变异速度最快，是引起病毒抗原变异最主要的原因[5]。已知乙型流病毒HA1上有4个抗原表位：120环(116-137)、150环(141-150)、160环(162-167)和190螺旋(194-202)，Victoria系的120环还包含75和77两个位点[6]。这些位点的氨基酸突变，往往引起病毒抗原性的改变。流感病毒出现新的变异种被定义为在抗原决定簇上有4个以上位点发生氨基酸替换，且替换涉及到2-3个抗原决定簇[7-9]。发生这种差异时，应警惕疫苗与当前流行株的匹配效果。本次研究发现，Victoria系毒株与疫苗株B/Brisbane/60/2008匹配较好，疫苗株对人群仍具有较好的保护效果。而Yamagata系中2010年和2015年疫苗株与毒株匹配性较差，毒株发生抗原漂移，需要更换疫苗株，故WHO在2015年2月及时推出了B/Phuket/3073/2013疫苗株来取代B/Massachusetts/2/2012疫苗株。我省乙型流感的两个种系常以一个种系为主混合流行，而WHO每年推荐的三价流感疫苗仅包含一个乙型流感成分，使得三价流感疫苗在保护人群预防流感的作用相当有限，此外WHO根据全球的流行情况推荐的疫苗株很难兼顾到所有的国家和地区，因此，有关卫生部门应该根据我国流感病毒变异及流感流行的实际情况，研制适合的流感疫苗，尤其是包含两个乙型种系的四价流感疫苗以提高疫苗的预防效果。另外，本研究还发现毒株与下轮疫苗株的匹配性更好，反应出疫苗株使用的滞后性，也提示我们应该及时更新乙型流感疫苗株，保证流感疫苗的防控效果。

HA 基因糖基化位点的改变包括位点数目增减、位置变化、糖链结构以及受体结合位点附近糖链的修饰等，这些改变不仅影响病毒的增殖和毒力，还影响病毒与宿主细胞受体的结合能力等[10]。本研究发现，与疫苗株相比Yamagata系毒株在HA蛋白的196位上增加一个糖基化位点，这个糖基化位点发现于20世纪90年代，是乙型流感病毒的特征之一[11-13]，这个位点位于HA蛋白抗原决定簇区的190环，同时也是受体结合位点，可能会影响抗体对病毒的识别和结合。另外，与同年份其他毒株相比，Yamagata系的B/Fujian-cangshan/1358/2010和Victoria系的B/Fujian-siming/1209/2010等毒株分别在某个位点缺少一个糖基化位点，认为这些毒株不是进化的主流，缺失的糖基化位点没有延续至下一年，而这些糖基化位点的变化是否影响病毒的增殖和适应性等，有待进一步的探索研究。

总之，本次基因分析表明，2010-2015年福建省乙型流感病毒两个种系的HA基因逐渐发生变异，尤其是B Yamagata系流感病毒已经出现抗原漂移现象，且WHO推荐的B Yamagata系流感疫苗株具有滞后现象，对人群不能提供良好的保护效果。今后在流感监测中要继续加强病原学监测，及时发现新的变异株，为疫苗研发、指导疫苗接种和疫情防控提供科学依据。

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Analysis of genetic characterization on hemagglutinin gene of influenza B virus isolated in Fujian province, 2010-2015

LinLihua,XieJianfeng,WengYuwei,ZhangYanhua,ZhaoLin,ZhengKuicheng

FujianCenterforDiseaseControlandPrevention，FujianKeyLaboratoryforZoonosesResearch，Fuzhou350001,China

LinLihuaandXieJianfengarethefirstauthorswhocontributedequallytothearticle

ZhengKuicheng,Email:kingdadi9909@126.com

Objective To understand the epidemiological and virological features of influenza B viruses and the difference between the vaccine strains and epidemic strains, the antigenic and genetic characteristics on hemagglutinin (HA) gene of influenza B viruses circulating in Fujian during 2010-2015. Methods The representative strains were selected randomly according to the lineage of influenza B viruses isolated from network laboratory in Fujian, 2010-2015. Viral RNA was extracted and gene fragments were amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR ) and the PCR products were sequenced. The complete HA gene sequence was obtained and analyzed via bioinformatics. Results Compared to the vaccine strains recommended by WHO，there were significant changes in genetic and antigenic characteristics on HA gene of B Yamagata lineage viruses from 2010 to 2015, especially in 2010, 2014 and 2015. There were major five amino acid residues substitutions (116, 150, 165, 196 and 202) involved in antigenic determinants, and the variable sites gradually increased as time on over. However, the variability of B Victoria lineage viruses on HA gene was less and there was no obvious trend over time. The results showed that the B Yamagata vaccine strains of 2010 and 2015 recommended by WHO had poor protective effect on influenza virus infection, while the B Victoria vaccine strain still play a satisfactory protective effect on humans in Fujian. Conclusions With time on, influenza B Yamagata lineage viruses had gradually mutated, causing a poorly match with vaccine strains in part of year, and emerging antigenic drift phenomenon. Strengthening further surveillance of mutations of B influenza virus remains essential to allow for early warning of influenza epidemic.

Influenza B virus;Hemagglutinin;Genetic characterization;Phylogenetic tree

福建省自然科学基金(2015J01294)；福建省医学创新课题(2014-CX-9)；福建省卫生系统中青年骨干人才培养项目(2015-ZGN-ZD-10)

郑奎城，Email：kingdadi9909@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.010

乙型流感病毒; 血凝素; 基因特征; 进化树

2016-09-27)