慢性肝病患者拉米夫定耐药毒株突变模式特征分析

欧阳雅博 李庆 魏飞力 张玉林 黄雁翔 宋晨朝 郭向华 谢放 王珊珊 陈德喜

100069 北京， 首都医科大学附属北京佑安医院 北京市肝病研究所

·论著·

慢性肝病患者拉米夫定耐药毒株突变模式特征分析

欧阳雅博 李庆 魏飞力 张玉林 黄雁翔 宋晨朝 郭向华 谢放 王珊珊 陈德喜

100069 北京， 首都医科大学附属北京佑安医院 北京市肝病研究所

目的 探讨拉米夫定(LAM)耐药毒株突变模式及HBV S基因相关变异在不同疾病进展慢性肝病患者中的特征。方法 收集LAM耐药慢性肝病患者的血液标本，获得相应的HBV RT基因核苷酸序列，分析耐药突变位点、药物耐受和耐药相关HBV S基因变异特点及组间差异。结果本研究纳入慢性乙型肝炎(CHB)患者47例，乙肝肝硬化(LC)和乙肝相关肝细胞癌(HCC)患者16例。M204I单点突变与L180M+M204I/V为LAM耐药的慢性肝病患者最常见突变形式(35/63，55.56%)。LC/HCC组对三种以上核苷(酸)类似物同时耐药人数高于CHB组(62.50% vs 34.04%，P=0.046)。LC/HCC组在HBV-S区检测到与免疫逃逸相关的HBsAg突变位点数多于CHB组(62.50% vs 31.91%，P=0.031)，I126T/V与G145A(LCC/HCC，60%)、I126S/T与S117T(CHB，46.67%)为HBsAg逃逸突变的最常见形式。两组患者均检测到RT区变异伴随HBsAg终止密码子的突变(rtA181T/sW172*和rtM204I/sW196*)。结论 不同疾病进展慢性肝病患者LAM耐药毒株突变及相关HBV S基因变异特征存在差异，LC/HCC患者多重耐药和免疫逃逸毒株比例高于CHB患者。

Fund programs: National Natural Science Foundation of China(81361120401)；Capital Health Research and Development of Special(2014-1-1151)； Beijing Talents Fund Supported Young Backbone Project(2015000021469G183)； You An Liver Disease and AIDS Foundation for Young Talent Incubation Project(YNKT20160015)

核苷(酸)类似物[nucleos(t)ide analogs，NAs]的广泛应用对延缓慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)病程进展，减少肝硬化(liver cirrhosis，LC)与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)发生起着关键作用[1]。然而我国抗病毒治疗的常用药物拉米夫定(Lamivudine，LAM)长期服用后可产生较高的耐药率并潜在增加患者对其他NAs的交叉耐药性[2]。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)P基因与S基因的开放读码框存在重叠，LAM治疗诱导的P基因的耐药突变可引起HBV表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)S基因氨基酸发生变异，这些变化可能影响患者的疾病进程和疫苗接种应答反应[3]。因此，本研究拟对LAM耐药的慢性肝病患者为研究对象，通过对其感染的HBV耐药突变模式及相关HBV S基因变异特征进行分析，以比较HBV在不同疾病进展患者中的突变特点。

1 材料与方法

1.1 一般资料 回顾性纳入2012年5月至2012年10月首都医科大学附属北京佑安医院LAM耐药的慢性肝病患者63例。其中，CHB和LC诊断均依据《病毒性肝炎防治方案》中的诊断标准，并排除重叠感染[4]；HCC的诊断按照《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》进行[5]。排除人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)及其他嗜肝病毒感染。收集患者血浆5 ml于-80℃冻存备用。本研究获北京佑安医院伦理委员会批准，所有患者在参与项目前进行了知情同意书签署。

1.2 方法

1.2.1 肝功能和HBV DNA定量检测：血清ALT、AST等肝功能指标采用OLMPUS-AU5400生化检测仪及其配套试剂检测。HBV DNA定量采用核酸荧光定量聚合酶链反应(美国ABI 7500 Fast Real time PCR仪及相关试剂盒)，单位为IU/ml。血清HBV标志物采用美国雅培公司的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测。

1.2.2 HBV DNA提取，目的片段扩增和测序：按照德国Qiagen公司HBV DNA提取试剂盒说明书操作提取血浆中HBV DNA后，参照文献获得P基因RT区序列[6]，阳性PCR产物送往公司测序。

1.2.3 序列分析：获得序列经Sequencher 5.2.4软件清理拼接后在斯坦福大学耐药数据库和HBV在线耐药解释工具进行耐药位点及HBsAg逃逸突变位点分析。利用BioEdit软件进行基于DNA序列的多序列比对用于组间突变位点比较。通过MEGA6.0软件中的邻位法及Kumura-2双参数模型，自展法重复运算1 000次构建基于HBV RT区的系统进化树用于HBV基因亚型确认。

1.3 统计学方法 组间人口学特征、临床特征及突变位点差异分析根据数据情况通过SPSS 17.0软件选择Mann-Whitney非参数检验、卡方检验或Fisher精确计算法检验进行统计分析；以双尾P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHB与LC/HCC患者人口学及临床特征比较 在LAM耐药的63例慢性肝病患者中，CHB患者47例(男性31例，女性16例)，LC患者8例(男性6例，女性2例)，HCC患者8例(男性7例，女性1例)。将所有患者分为两组，通过比较可见(表1)，除LC/HCC组的年龄及天门冬氨酸氨基转移酶(AST)大于CHB组外(均P<0.05)，两组在性别、HBsAg阳性比例、HBeAg阳性比例、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、HBV DNA水平及基因型方面差异无统计学意义。

2.2 CHB与LC/HCC患者HBV-RT区耐药突变模式比较 63例慢性肝病患者除检测到LAM耐药相关突变位点外，阿德福韦酯(Adefovir dipivoxil，ADV)(A181T/V，N236T)与恩替卡韦(Entecavir，ETV)(T184A/I/S，S202G，M250I/V)耐药位点也被检测到。M204I单点突变与L180M+M204I/V为LAM耐药的慢性肝病患者最常见突变形式(35/63，55.56%)。CHB组与LC/HCC组的HBV-RT区耐药突变模式前三位构成差异无统计学意义(χ2=4.042，P=0.257)。63例患者所检测到的LAM耐药相关位点全部可导致替比夫定(Telbivudine，LdT)耐药，而对三种以上NAs同时耐药(LAM/LdT+ADV/ETV)的患者比例在两组患者间差异有统计学意义(χ2=3.988，P=0.046)，LC/HCC组(10/16，62.50%)高于CHB组(16/47，34.04%)。

表1 慢性肝病患者人口学及临床特征比较

注：a， Mann-Whitney检验; b，卡方检验; c， Fisher精确计算法检验; d， 中位数 (范围)*P<0.05

Note: a， Mann-Whitney test; b，chi-square test; c， Fisher’s exact test； d， Median (Range)*P<0.05

表2 慢性肝病患者基因型耐药时HBV S基因的突变

2.3 CHB与LC/HCC患者耐药相关HBV S基因变异比较 本研究中39.68%的慢性肝病患者(25/63)可在HBV-S区检测到与免疫逃逸相关的HBsAg突变位点(表2)，其中LC/HCC组(10/16，62.50%)检出比例高于CHB组(15/47，31.91%；χ2=4.665，P=0.031)。通过比较慢性肝病患者基因型耐药时HBV S基因的突变类型，LC/CHB组HBsAg逃逸突变的最常见形式为I126T/V与G145A(6/10，60%)，CHB组HBsAg逃逸突变比例最高的为I126S/T与S117T(7/15，46.67%)。慢性肝病患者中也可检测到RT区变异伴随HBsAg终止密码子的突变(突变类型包括rtA181T/sW172*、rtV191I/sW182*、rtM204I/sW196*和rtV207I/sW199*)(表2)，CHB组(19/47，40.43%)与LC/HCC组(3/16，18.75%)检出比例差异无统计学意义(χ2=2.468，P=0.116)。

3 讨论

LAM仍是目前我国临床进行抗HBV治疗的主要药物，其在慢性肝病患者中长期广泛应用后，通过对HBV P 基因和S基因产生选择压力导致携带特异突变位点的HBV耐药毒株出现并增加免疫逃逸毒株产生的风险，这可导致LC和HCC的发生风险增加，提高了治疗难度和长期治疗的医疗成本[7]。本研究所纳入的研究对象为曾单用或联用LAM的慢性肝病患者，故ADV与EFV的耐药相关突变位点也可被检测到。对于LAM耐药，V173L和L180M是公认的M204V的代偿性耐药突变位点[8]。本研究中M204I单点突变与L180M+M204I/V为LAM耐药慢性肝病患者最常见突变形式。LC/HCC组对三种以上NAs同时耐药的患者比例明显高于CHB组，提示多重耐药的发生在不同疾病进展肝病患者中存在差异。

HBsAg是HBV穿膜蛋白同时也是人免疫系统发挥作用的重要靶位，其突变所引起的免疫逃逸可导致一些中和抗体不能识别[9]。本研究显示39.68%的慢性肝病患者可在HBV S区检测到与免疫逃逸相关的HBsAg突变位点，其中LC/HCC组检出比例高于CHB组，这说明在NAs药物压力下LC/HCC组产生了更多的免疫逃逸毒株。与免疫逃逸相关的HBsAg突变位点的出现可能或多或少改变HBsAg的抗原性，这也是对目前商品化HBsAg诊断试剂及乙肝疫苗免疫的挑战。HBV感染者体内存在复杂的准种，因此，基于Sanger测序结果获得的HBV准种优势种群RT区特征分析及预测可能会与血清HBV标志物检测结果存在不一致现象。另外HBsAg可发生终止密码子提前产生的突变类型，将导致截短的HBsAg表达，使病毒粒子和亚病毒颗粒从感染细胞中的分泌受阻[10]。本研究慢性肝病患者中可检测到RT区变异伴随HBsAg终止密码子的突变，且两组均检测到rtA181T/sW172*。rtA181T/sW172*突变不仅对LAM和ADV耐药，而且被报道与疾病进展和HCC的发生相关，其潜在危险性可能是HBsAg细胞内潴留可产生显著内质网应激从而导致持续的肝细胞损伤和再生[9]。因此，在大规模推广NAs抗病毒治疗的背景下，明确慢性肝病不同进展患者HBV的耐药突变模式和S基因突变情况有利于了解病毒的进化方向和适应性改变对疾病进程的影响。

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Analysis of Lamivudine-resistant variants mutation patterns in patients with chronic hepatitis disease

OuyangYabo,LiQing,WeiFeili,ZhangYulin,HuangYanxiang,SongChenzhao,GuoXianghua,XieFang,WangShanshan,ChenDexi

BeijingInstituteofHepatology,YouAnHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100069,ChinaCorrespondingauthor:ChenDexi,Email:dexichen@ccmu.edu.cn

Objective To investigate the genetic characteristics of Lamivudine-resistant mutation patterns and HBV S gene mutants in patients with chronic hepatitis disease of different disease progression. Methods Blood samples of LAM-resistant patients with chronic hepatitis disease were collected. HBV RT gene nucleotide sequences were obtained, and then differences in drug-resistant mutation patterns, drug susceptibility and HBV S gene mutants characteristics between the two groups were analyzed. ResultsForty-seven chronic hepatitis B (CHB) patients and 16 HBV-related liver cirrhosis (LC)/HBV-related hepatocellular carcinoma (HCC) patients were included in this study. M204I single point mutation and L180M+M204I/V were the most common pattern during patients with chronic hepatitis disease (35/63，55.56%). The numbers of resistant to three nucleos(t)ide analogues in LC/HCC group was higher than CHB group’s (62.50% vs 34.04%,P=0.046). In HBV S gene, more immune associated HBsAg-escape mutations were detected in LC/HCC group than that in CHB group (62.50% vs 31.91%,P=0.031). I126T/V and G145A (for LCC/HCC group, 60%), I126S/T and S117T (for CHB group, 46.67%) were showed as the most common form for HBsAg escape mutations in the two groups. The two groups both detected RT mutations concomitantly with stop codon mutations in S gene (rtA181T/sW172* and rtM204I/sW196*). Conclusions Different characteristics in Lamivudine-resistant mutations and associated HBV S gene mutants were found in patients with chronic hepatitis disease of different disease progression, and LC/HCC patients exhibit more multi-drug resistant variants and immune associated HBsAg-escape mutants than CHB patients.

Hepatitis B virus; Chronic hepatitis diseases; Lamivudine; Drug-resistant mutation; S gene mutants

陈德喜，Email: dexichen@ccmu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.006

肝炎病毒，乙型; 慢性肝病; 拉米夫定; 耐药突变; S基因突变

国家自然科学基金(81361120401)；首都卫生发展科研专项(2014-1-1151)；北京市优秀人才培养资助青年骨干个人项目(2015000021469G183)；佑安肝病艾滋病基金资助中青年人才孵育项目(YNKT20160015)

2016-04-11)