聚集性感染甲型H1N1流感病毒的HA1基因特征分析

杨鹏飞 燕清丽 马雪征 张丽萍 甄维 刘纯成 邢亚东 姚海波 何南江 胡孔新

223001 淮安市疾病预防控制中心(杨鹏飞、燕清丽、刘纯成、邢亚东、姚海波、何南江)；100123 中国检验检疫科学研究院卫生检疫研究所(马雪征、张丽萍、胡孔新)；102206 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(甄维)

·论著·

聚集性感染甲型H1N1流感病毒的HA1基因特征分析

杨鹏飞 燕清丽 马雪征 张丽萍 甄维 刘纯成 邢亚东 姚海波 何南江 胡孔新

223001 淮安市疾病预防控制中心(杨鹏飞、燕清丽、刘纯成、邢亚东、姚海波、何南江)；100123 中国检验检疫科学研究院卫生检疫研究所(马雪征、张丽萍、胡孔新)；102206 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(甄维)

杨鹏飞、燕清丽为并列第一作者

目的 了解淮安市某中学一起引起聚集性感染的流感病毒HA1基因特征。方法 采用实时荧光RT-PCR方法进行病原体的快速检测，对分离的毒株进行HA1基因扩增、测序及构建系统发生树并进行HA1基因特征分析。结果 从流感样病例中检测出11份甲型H1N1流感病毒阳性，与疫苗株A/California/07/2009核苷酸及氨基酸同源性分别为97.7%-98.1%及96.6%-97.4%。引起本次疫情的甲型H1N1流感病毒株与2014年分离的毒株聚集在一起。序列分析提示淮安分离株受体结合位点及糖基化位点的氨基酸序列均未发生变异，在抗原决定簇Ca1区均发现变异，为S220T。结论 引起本次聚集性疫情的病原体为甲型H1N1流感病毒，尽管淮安株在抗原决定簇Ca1区存在氨基酸突变，但其抗原性未发生改变。

Fund programs: National Science and Technology Major Project of China on Infectious Disease Control and Prevention(2013ZX10004101-006)；Huai’an Preventive Medicine Association Project (hayf201516); Huai’an Scientific Technological Special Project (HAS2015019-3).

流感病毒属于正黏病毒科流感病毒属，为单负链分节段具有包膜结构的RNA病毒[1]。根据流感病毒膜表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)及神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)抗原差异性可将甲型流感病毒分为HA18个亚型，NA分11个亚型[2,3]。其中HA主要参与机体免疫，对于病毒的感染力至关重要。HA基因易发生变异，特别是HA1基因区的高频率变异是流感病毒发生遗传变异的分子基础，甲型流感病毒的抗原决定簇主要集中在HA1基因区，HA1基因变异表现为抗原漂移和抗原转换，容易导致甲型流感病毒的暴发及大流行[4-7]。因此分析甲型流感病毒HA1基因特征有助于了解病毒抗原性变化，从本质上揭示流感病毒分子结构的变异与流行关系, 从而为流感疫情防控提供理论依据。

2009年甲型H1N1流感病毒首次在美国和墨西哥患者中检测到，随后通过人传人途径导致全球大流行，严重威胁全球的公共卫生[8-10]。自2010年10月后，甲型H1N1流感进入了大流行的后期。至今，甲型H1N1流感依然在世界各地不断发生流行。甲型H1N1流感病毒传染性强、传播速度快，主要通过空气和密切接触传播，同其他甲型流感病毒一样在临床上表现以发热、流涕、咳嗽、头痛为主[8,9]。

2013年12月，淮安市某中学学生发生以发热、咳嗽、咽痛为主要症状的流感样暴发疫情。经现场流行病学调查和对其中部分患者标本用分子生物学、病原学等方法进行检测，结果证实这起疫情是由甲型H1N1流感病毒引起的。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 样本来源 2013年12月10日-2013年12月13日淮安市某中学学生中出现发热、体温>37.5℃，伴有头痛、头晕、咽痛、咳嗽症状的学生。

1.2 流行病学调查 按照《甲型H1N1流感监测方案 (第二版)》对疑似或确诊病例进行流行病学相关调查，同时无菌采集相应病例的咽拭子，低温运送至淮安市疾病预防控制中心检验科进行检测。

1.3 人咽拭子RNA提取 利用Qiagen公司的病毒核酸提取试剂盒对上述样本按照说明书进行人咽拭子RNA提取，并于-80℃保存。

1.4 实时荧光RT-PCR检测 利用硕世生物公司的A/B双重实时荧光PCR检测试剂盒、H3N2、甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR检测试剂盒对上述样本RNA进行检测。

1.5 病毒分离 选择Ct值较小(通常Ct值≤28.0)的咽拭子标本接种于长成单层的处于对数生长期的狗肾细胞(Madin darby canine kidney, MDCK)，按照《流行性感冒诊断标准及处理原则》及《全国流感监测技术指南》中的操作步骤进行病毒分离及红细胞凝集试验。

1.6 病毒的HA1基因的扩增 利用Qiagen公司的One Step RT-PCR Kit进行甲型H1N1流感病毒HA1基因的RT-PCR扩增，扩增反应条件为：42℃逆转录90 min，95℃ 5 min；95℃变性30 s、52℃复性30 s、72℃延伸1 min 30 s，共进行40个循环；72℃ 延伸10 min。纯化产物送上海英潍捷基有限公司进行测序。

1.7 序列分析 用DNASTA软件包中的MegAlign软件进行基因序列排序及同源性分析，用MEGA5.0软件进行序列对齐、氨基酸分析并将比对的核苷酸序列转化为BEAST1.75软件所用的文件，利用Bayes法，以GTR替代模型运行20 000 000代进行建树，利用FigTree v1.3.1软件进行图形分析。用于比较分析的甲型H1N1流感病毒的HA1序列均来自于GenBank。

2 结果

2.1 流行特征 该校自2013年12月10日至13日被诊断为流感病例的共有11例，罹患率为14.86%。这次暴发的病例均在一个班级，该校其他班级没有发现类似病例。11例病例中男女比例为4.5∶1，年龄段均在14岁-15岁。该校全部学生一年内未接种过流感疫苗。

2.2 实时荧光RT-PCR检测 对采集的18份咽拭子样本进行实时荧光RT-PCR反应，结果显示有11份标本检测为甲型H1N1流感病毒核酸阳性。

2.3 病毒分离培养 接种实时荧光RT-PCR反应阳性且Ct值≤28.0的样本7份，进行MDCK细胞培养。盲传3代后，有5份样本分离到毒株。

表1 淮安分离的甲型H1N1流感病毒株与疫苗株在抗原决定簇位点中的氨基酸比较

注：加粗的为与淮安株发生突变的氨基酸

Note: The new mutations of Huai’an strains are shown with the type of boldface

2.4 同源性分析 利用RT-PCR法从5份分离的毒株中扩增甲型H1N1流感病毒的HA1基因片段并进行测序。分离的毒株A/Huai’an/ILI12002/2014、A/Huai’an/ILI12005/2014、A/Huai’an/ILI12007/2014、A/Huai’an/ILI12010/2014及A/Huai’an/ILI12022/2014均扩增出HA1基因序列。5株间的HA1基因片段的核苷酸同源性为99.2%-99.9%，氨基酸同源性为98.6%-99.9%，与疫苗株A/California/07/2009核苷酸及氨基酸同源性分别为97.7%-98.1%及96.6%-97.4%；与A/Yunnan-Zhaoyang/SWL1917/2014的同源性最高，分别99.2%-99.6%(核苷酸)和98.9%-99.7%(氨基酸)；与A/Anhui-Xiangshan/SWL1894/2014、A/HK/7345/2014 的核苷酸同源性均>98.8%，氨基酸同源性均>98.3%；与A/Zhejiang/TZ11/2013核苷酸同源性﹤98.7%，氨基酸同源性均﹤98.6%；与A/Zhejiang/HuZ1/2012的核苷酸及氨基酸同源性均﹤97.8%。进一步分析发现淮安市聚集性感染的甲型H1N1流感病毒株与2009-2010年江苏省境内分离的毒株A/Jiangsu/1/2009、A/Nanjing/1/2009、A/Nanjing/1/2010 及A/Taizhou/09/2009的同源性核苷酸及氨基酸同源性均﹤98.4%。

2.5 甲型H1N1流感病毒的系统进化分析 由HA1基因片段构建的系统进化树见图1，分离的病毒株A/Huai′an/ILI12002/2014、A/Huai′an/ILI12005/2014、A/Huai′an/ILI12007/2014、A/Huai′an/ILI12010/2014及A/Huai′an/ILI12022/2014聚集在一起，在进化关系上与云南分离株A/Yunnan-Zhaoyang/SWL1917/2014和安徽分离株A/Anhui-Xiangshan/SWL1894/2014最近，并与中国香港毒株A/HK/62/2015、A/HK/7345/2015及浙江分离株A/Zhejiang/TZ11/2013、A/Zhejiang/HuZ1/2012等共同分在一个进化分枝内。淮安分离的毒株与疫苗株A/California/07/2009及A/Hangzhou/04/2009的进化关系最远。值得注意的是淮安分离的毒株与江苏省境内分离的毒株A/Jiangsu/1/2009、A/Nanjing/1/2009、A/Nanjing/1/2010 及A/Taizhou/09/2009分在不同的进化枝内。

2.6 抗原决定簇及受体位点分析 甲型H1N1流感病毒的HA1基因区上分布着HA的全部4个抗原决定簇，分别为Sa、Sb、Ca及Cb[4,6,11]。本研究中分离的毒株与疫苗株A/California/07/2009相比A/Huai′an/ILI12007/2014的5个抗原决定簇中各氨基酸位点均未发生变异，而A/Huai′an/ILI12002/2014、A/Huai′an/ILI12005/2014、A/Huai′an/ILI12010/2014及A/Huai′an/ILI12022/2014存在变异，主要在抗原决定簇Ca1区220氨基酸位点由S突变成T，值的注意的是A/Huai′an/ILI12002/2014在抗原决定簇Sb区202氨基酸位点也存在变异，为S→T(表1)。

进化树中不同的颜色代表不同的clade(进化簇)，其中红色加粗为本研究中分离的病毒，进化枝上显示≥0.50后验概率图1 淮安分离株的系统进化树Different clades of phylogenetic tree are indicated by different color, and the isolates in this study are shown in red with the type of boldface, with posterior node probabilities(≥0.50) showed above branchFig.1 Phylogenetic tree of Huai′an isolates

甲型H1N1流感病毒受体结合位点(Receptor binding sites，RBS)位于HA三聚体中每个单体的头部，主要由190螺旋(190-198)130环(135-138)和220环(221-228)3个结构的氨基酸残基组成[11]。经氨基酸序列比对发现，与A/California/07/2009相比，均没有发现有氨基酸位点变异。

2.7 糖基化位点分析 HA蛋白经过进一步的加工修饰如空间结构变化、水解、氨基酸位点的糖基化等才能成为结构蛋白，其中氨基酸位点的糖基化对病毒与受体的结合能力、病毒与抗体的结合能力、HA蛋白的裂解等生物学特性方面均有直接的影响[7,12]。本研究中发现淮安分离的毒株与疫苗株A/California/07/2009相比，在糖基化位点27(N-N-S-T)、28(N-S-T-D)、40(N-V-T-V)、104(N-G-T-C)、293(N-T-T-C)、304(N-T-S-L)处均未发生氨基酸突变、缺失或增加。

3 讨论

甲型H1N1流感病毒自2009暴发后，逐渐替代季节性H1N1流感病毒，成为流感流行季节中常见的病原体。在流感季节，特别是一些人群密集的地方，如医院、学校等，往往会成为流感流行及传播区。聚集性流感样病例的出现往往与当年流行的流感类型有一定的提示作用。结合本次聚集性病例的临床症状、流行病学调查、流感流行季节特点，应用实时荧光RT-PCR方法检测、分离病毒及HA1基因扩增测序，最终确定引起本次疫情暴发的病原体为甲型H1N1流感病毒。

甲型流感病毒的抗原漂移主要取决于HA1基因的变异，也直接决定了流感的流行及流行规模的大小[4,5]。本研究中以引起聚集性感染病例的甲型H1N1流感病毒为研究对象，选择HA1基因片段为关注点，从同源性、系统进化、关键氨基酸位点(抗原决定簇位点、受体结合位点及糖基化位点)变异与国内代表株及国际推荐疫苗株进行比对分析。在本研究中发现引起淮安市某中学的聚集性病例的病毒株与A/Yunnan-Zhaoyang/SWL1917/2014、A/Anhui-Xiangshan/SWL1894/2014及A/HK/7345/2014的同源性较高，而与江苏省分离株A/Jiangsu/1/2009、A/Nanjing/1/2009、A/Nanjing/1/2010 及A/Taizhou/09/2009同源性较低，同时结合进行发现淮安分离株与A/Yunnan-Zhaoyang/SWL1917/2014、A/Anhui-Xiangshan/SWL1894/2014及A/HK/7345/2014聚集在一个进化枝内，而与江苏省分离株A/Jiangsu/1/2009、A/Nanjing/1/2009、A/Nanjing/1/2010 及A/Taizhou/09/2009则分属不同的进化单元，这提示甲型H1N1流感病毒HA1基因的演化特征为变异在时间分布上有明显差异，而同一时间段的变异基本相同或相近并且不呈现与地域分布的差异性[13]。

值得注意的是本研究中分离的毒株中，1株(A/Huai′an/ILI12007/2014)在抗原决定簇区未发生变异，3株(A/Huai′an/ILI12005/2014、A/Huai′an/ILI12010/2014及A/Huai′an/ILI12022/2014)在抗原决定簇的Ca1区220氨基酸位点发生变异，1株(A/Huai′an/ILI12002/2014)在抗原决定簇Ca1区220氨基酸位点及Sb区202氨基酸位点同时发生变异，这提示流感病毒感染后存在准种，可能是机体免疫差异导致流感病毒面临不同的选择压力而进行的基因突变[14,15]。通常情况下甲型H1N1流感病毒HA1区至少有4个氨基酸序列发生替代且替换必须涉及2-3个抗原决定簇位点上，才会引起抗原漂移，导致流感新种产生[11]。因此淮安分离株的抗原性没有发生改变。

本研究中发现尽管淮安分离的毒株与疫苗株A/California/07/2009的核苷酸同源性﹤98.1%，氨基酸同源性﹤97.4%，但是对其抗原结合位点、糖基化位点分析发现与疫苗株相比均未发生变异；虽然淮安分离株在抗原决定簇位点中有1-2个基酸位点发生变异，但不足以引起病毒的抗原性发生改变，因此国际推荐的疫苗株有免疫保护作用。

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Analysis of HA1 gene of influenza A H1N1 pdm09 virus from a clustered human cases

YangPengfei,YanQingli,MaXuezheng,ZhangLiping,ZhenWei,LiuChuncheng,XingYadong,YaoHaibo,HeNanjiang,HuKongxin

Huai’anCenterforDiseaseControlandPrevention,Huai’an223001,China(YangPF,YanQL,LiuCC,XingYD,YaoHB,HeNJ);ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,InstituteofHealthQuarantine, 100123Beijing,China(MaXZ,ZhangLP,HuKX);NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChinaCDC, 102206Beijing,China(ZhenW)YangPengfeiandYanQingliarethefirstauthorswhocontributedequallytothearticleCorrespondingauthor:HuKongxin,Email:hukongxin@caiq.gov.cn;HeNanjiang,Email:hahnj110@163.com;

Objective To understand the viral etiology of a clustered case of human infection outbreak in the middle school of Huai’an city. Methods Nasopharyngeal swab samples from patients were collected and rapidly detected by Real-time RT-PCR and the target virus isolated in cells. Furthermore, HA1 segments of target virus were amplified by RT-PCR and sequenced. The genetic and phylogenetic analysis based on HA1 genes was computed. Results Influenza A(H1N1)pdm09 viral nucleic acid in 11 nasopharyngeal swab samples from patients in the outbreak were positive. Compared to the vaccine strains A/California/07/2009, the Huai’an isolates, nucleotide identity was 97.7%-98.1%, and amino acid identity was 96.6%-97.4%. Phylogenetic analysis of HA1 segment sequences indicated that the Huai’an strains from the outbreak were related closely to the viruses isolated in the year of 2014. Sequence analysis indicated that the Huai’an isolates had no amino acid substitution in the receptor binding sites and glycosylation sites, while in the Ca1 of antigenic determinant of HA1 the Huai’an isolates had an amino acid substitution of S for T at 220. Conclusions The pathogen of the clustered case of human infection was Influenza A(H1N1)pdm09 virus. Though the Huai’an isolates had one animo acid substitution in the Ca1 of antigenic determinant, the antigenicity characteristic remained unchanged.

A clustered case; Influenza A(H1N1)pdm09 virus; HA1 gene; Phylogenetic analysis; Amino acid substitution

胡孔新，Email：hukongxin@caiq.gov.cn；何南江，Email：hahnj110@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.009

聚集性病例；甲型H1N1流感病毒；HA1基因；进化分析；氨基酸变异

国家传染病重大科技专项(2013ZX10004-101-006)；淮安市预防医学会科研基金(hayf201516);淮安市科技局科研项目(HAS2015019-3)

2016-02-29)