斑贞1号联合TMP、5—FU对人胃癌细胞CDX2基因表达影响

张爱民+郭元虎+郝旺胜+马振华

[摘要] 目的 探讨斑贞1号联合TMP、5-FU逆转人胃癌细胞系SGC-7901/ADR与CDX2相关性。 方法 从2015年6—12月在包头医学院第一附属医院中心实验室进行SGC7-901/ADR细胞培养，设①空白对照组、②5-FU组、③斑贞1号组、④5-FU+斑贞1号组、⑤5-FU+斑贞1号+ TMP组观察细胞毒性，选取各个药物组作用浓度分别提取总mRNA，采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）监测人胃癌细胞SGC-7901/ADR细胞在不同药物组的尾型同源基因 2（caudal- re lated hom e- odom aintranscription factor 2， CdX2）mRNA的表达情况。结果 对照组CDX2 mRNA 表达量为（2.01±0.26），5-FU组CDX2mRNA表达量为（1.94±0.24），5-FU组与阴性对照组相比差异无统计学意义（P>0.05），而5-FU联合斑贞1号及TMP处理组CDX2 mRNA表达量为（0.44±0.07），与其他组明显降低比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 斑贞1号联合TMP及5-FU逆转人胃癌SGC-7901/ADR细胞耐药性可能与CDX2基因相关。

[关键词] 胃癌；斑贞1号；TMP； 5-FU； 多药耐药；CDX2基因

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）01（a）-0032-04

在我国，胃癌的发生率和死亡率居恶性肿瘤前3[1]，手术治疗一直是胃癌的首选治疗手段，但除日本外的大多数国家早期诊断率较低，因此根治手术率仍然较低，化疗在胃癌治疗中显得十分重要，但目前遇到最大问题是胃癌多药耐药性（MDR），近几年发现尾型同源基因 2（caudal- re lated hom e- odom aintranscription factor 2， CdX2）在胃癌细胞的多药耐药性调节中扮演重要的角色。侯培珍[2]研究结果示斑贞1号、5-FU 和TMP联合对人胃癌SGC-7901/ADR细胞有明显的逆转作用。该实验从2015年6—12月在包头医学院第一附属医院中心实验室进行SGC7-901/ADR细胞培养，采用RT-PCR比较人胃癌细胞SGC-7901/ADR细胞在不同药物组CDX2mRNA的表达量，进一步探讨斑贞1号 + 5-FU+TMP对人胃癌SGC-7901/ADR细胞的作用机理，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

细胞系胃癌SGC-7901/ADR细胞（人胃癌细胞）。

1.2 药物、试剂及主要仪器

自拟“斑贞1号”每mL含露蜂房、山茱萸、斑蝥、女贞子各0.2 g。5-FU （规格10 mL：0.25 g，国药准字H310 20593）、TMP（规格40 mg，国药准字H20031302）、RPMI1640培养基（RPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写，1640是培养基代号）。其中含有10%胎牛血清，二甲基亚砜、胰蛋白酶，新生小牛血清两步法RT-PCR试剂盒，Trizol，引物，PCR扩增仪、电泳仪（DF-D）、紫外分光度计、紫外透视成像系统。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞处理 以5×104/mL接种于6孔板上，每孔2 mL，培养24 h后，实验孔依次加入等量的新的培养液； 5-FU稀释液；斑贞1号稀释液；斑贞1号 + 5-FU稀释液；斑贞1号 + 5-FU+TMP稀释液（选取各自的IC50值）。培养48 h后，PBS缓冲液冲洗，准备提取总mRNA。

1.3.2 RT- PCR检测 以mRNA为模板经逆转录合成cDNA， 每个反应体系25 uL，目的基因引物各0.5 uL，Takara Taq 1 uL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus） 2.5 uL，dNTP Mixture 2 uL，ddH2O 13.5 uL；各樣品cDNA5 uL，β -action的正义列为5'-AGAGCGGCATGAAGAAGGAGTG-3'，反义列为5ˊ-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，CDX2基因序列的正义列引5-TCAGACCTACGCCGAATATGC-3，反义列引物为5'-GAAATGGGAGAAGGTAGTGTCAAA-3'，灭菌蒸馏水13.5 uL。预变性→变性→退火→延伸条件分别是、98℃、2～4 min→98℃、8 s→55℃、12 s→72℃、55 s，共30个循环，最后延伸72℃ 10 min。扩增结束，取样品10 uL，经100 V恒压，2%琼脂糖电泳60 min，采集电泳图像，凝胶图象分析系统扫描得出各电泳带光密度值（即目的条带与内参条带光密度比值）。

1.4 统计方法

应用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，并采用LSD t检验， P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SGC7901/ADR细胞经不同药物处理后CDX2 mRNA的表达

5-FU组与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。其他药物组与对照组及组间比较均差异有统计学意义。

2.2 CDX2和β-action的RT-PCR产物经琼脂糖分离的表达

CDX2和β-action的RT-PCR产物经琼脂糖分离后分别位于247bp和548bp。A、B、C、D、E为CDX2表达，A1、B1、C1、D1、E1为β-action的表达。

3 讨论

胃癌是中国常见的恶性肿瘤之一，至今为止手术仍是胃癌的主要治疗方法。因早癌诊断率低，多数患者失去手术机会，所以化疗在胃癌治疗中显得十分重要，但目前遇到最大问题是胃癌多药耐药性（MDR），郝旺胜等[3]研究发现人胃癌SGC-7901/ADR细胞对5-FU相对耐药性为97.49%；有日本学者[4-5]发现 CDX2 是肿瘤多药耐药性重要控制基因 MDR1 的直接上游基因通过构建 CDX2 沉默的病毒载体转染SGC7901/DDP，发现胃癌细胞对顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶等化疗药物的敏感性增加，将药物泵出细胞的效率降低，胃癌细胞株的凋亡增加，并促使胃癌细胞停滞于 M 期；储婧等[6]研究发现CDX2和肠型claudin- 3胃黏膜肠化生及肠型胃癌中表达具有相关性， Bae等[7]研究发现，CDX2 的表达与结肠、直肠癌密切相关，且可作为结直肠癌的预后评估指标。Bonhomme 等[8]研究表明CDX2在结直肠癌组织中呈低表达， 能抑制肿瘤的发生且CDX2表达的减少与结直肠癌的预后不良有关，Hong KD等[9-10] CDX2在结直肠癌中表达研究的分析结果，在高中分化癌组织中的表达明显高于在低分化癌组织中的表达。肖焘等[11]研究发现 C D X2属于肠道特异性的核转录因子， 对肠上皮细胞正常形态和功能维持起一定的作用基因长度22～23 KB，由3个外显子和2个内含子构成，参与肠道发育过程多个步骤调节，主要有细胞增殖、分化、迁移及恶变，在早期肠分化中起重要作用[12]；在正常状态下其表达难以测定，但在内毒素、细胞因子、癌基因等多种刺激因子下，可明显表达[13-14]。CDX2促进肿瘤发生的机制主要是诱导细胞增殖、促进肿瘤新生血管的生成，同时抑制机体抗肿瘤的免疫应答反应[15-16]，斑贞1号合剂（斑蝥、露蜂房、女贞子、山茱萸），主要斑蝥素主要是抑制肿瘤细胞核苷酸合成，起到解毒杀瘤、杀伤肿瘤同时无骨髓抑制作用。女贞子对染色体损伤具保护作用。TMP可通过多种途径，逆转多药耐药，对肿瘤起到治疗作用。杨叶等[17]研究已证实TMP能显著增加SGC-7901/ADR细胞对5-FU的敏感性；斑贞1号和TMP联合5-FU对人胃癌细胞有较强的逆转作用。该研究显示对照组CDX2 mRNA 表达量为（2.01±0.26），5-FU组CDX2mRNA表达量为（1.94±0.24），5-FU组与对照组比较COX-2mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05），说明COX-2参与耐药细胞对5-FU的耐药性。斑贞1号和TMP联合5-FU组COX-2mRNA表达量为（0.44±0.07），明显低于其他用药组，差异有统计学意义（P<0.05），说明可显著抑制耐药细胞COX-2mRNA的高表达，克服了由COX-2基因介导的多药耐药性，增强了治疗效果。

综上所述，斑贞1号联合TMP及5-FU可以逆转人胃癌SGC-7901/ADR细胞耐药性，并初步探讨其影响人胃癌耐药细胞株的分子机制，为胃癌耐药性逆转的基因治疗打下理论基础，值得推广，体外试验结果在体内是否能发挥相同的作用，有待于进一步的研究和探讨。如果实验条件允许，不仅局限于CDX2的研究，可以进行多基因研究，此外选用实时荧光定量PCR实验就会更加完美。

[参考文献]

[1] Bosolino A， Cravero A， Ratto R. Gastric metastases： not only identified at autopsies [J].Actagastroenterologica Latinoameri cana，2013，43（4）：316-320.

[2] 侯培珍，张娟，赵永峰.中西药结合对胃癌细胞多药耐药性逆转和诱导凋亡的实验研究[J].第四军医大学学报，2008， 29（13）：1181-1183.

[3] 郝旺胜，侯先文，侯培珍.斑贞1号联合氟尿嘧啶对胃癌细胞SGC-7901/ADR的细胞毒作用[J].临床荟萃，2008，23（24）：1762-1764.

[4] Y Takakurar，T Hinoi，N Oue，et al. CDX2 regulates multidrug resistanue 1 gene expression in malignant intestinal epitelium[J]. Cancer Research，2010，70（17）：6767-6778.

[5] Yan LH， Wang XT， Yang J，et al. Reversal ofmultidrug resistance in gastric cancer cells by CDX2 downregulation[J].World journal of gastroenterology：WJG，2014，18（26）：4150-4155.

[6] 儲婧，秦蓉，王娜娜.胃癌及癌旁组织中 CDX2 和 clau- 等.din- 的表达及其意义[J].临床与实验病理学杂志，2011， 3.27（12）：1280-1282.

[7] Bae J M，Lee T H，Cho N Y，et al. Loss of CDX2 expression is associated with poor prognosis in colorectal cancer patients[J]. 2015（5）：1457-1467.

[8] Bonhomme C， Duluc I， Martin E，et al.The Cdx2 homeobox gene has atumour suppressor function in the distal colon inaddition to a homeotic role during gut development[J].Gut，2003（52）：1465-1471.

[9] Hong KD， Lee D， Lee Y，et al.Reduced CDX2 expression predicts poor overall survival inpatients with colorectal cancer[J].Am Surg，2013（79）：353-360.

[10] Olsen J， Espersen ML， Jess P， et al.The clinical perspec tives of CDX2 expression in colorectal cancer： a qualitative systematic review[J]. Surg Oncol，2014（23）：167-176.

[11] 肖焘，蔡军.CDX2与肿瘤的研究进展[J].南昌大学学报：医学版，2011（51）： 84-88.

[12] 高光，金仁顺.SP 和 CDX2 表达的胃黏膜上皮化生胃癌的关系研究[J].肿瘤学杂志 2016，22（4）：291-293.

[13] 蒋伟，张健锋，毛振彪.胃癌组织及外周血中 CDX2 基因甲基化的关系及其临床意义[J].交通医学，2015，29（4）：329-331.

[14] 毛宏杰.CDX2与Barrett食管的相关性研究[J].中外医疗，2010，29（13）：40.

[15] 冯焕然，段巨洪，武文杰，等.胃癌患者血清炎性因子水平检测的临床意义[J].新乡医学院学报，2014，31（4）：284-286.

[16] 黎敏，李翠文，侯培珍.中西药联合对人胃癌SGC-7901/ADR细胞Bcl-2与Bax基因表达的影响[J].中外医疗， 2013， 32（7）：11-13.

[17] 杨叶，侯培珍，张娟.川芎嗪联合氟尿嘧啶对胃癌细胞SGC- 7901/ADR的杀伤作用[J].肿瘤防治研究，2008，35（9）：624-626.

（收稿日期：2016-10-09）