莱氏野村菌产孢培养基的正交优化设计

杨淑仪+王彦+管清真+陶新娉+刘守柱

摘要：研究不同碳源和氮源對莱氏野村菌[Nomuraea rileyi （Farlow） Samson]培养性状的影响，并筛选出产孢能力最强的培养基。以SMAY为基础培养基，分别更换碳源和氮源，研究培养性状的差异；采用正交试验对碳源和氮源含量进行优化。结果表明，不同碳源对莱氏野村菌有不同的作用，单糖类碳源有利于产孢，多糖类碳源有利于菌落生长，最有利于产孢的碳源是葡萄糖；酵母提取物是最有利于莱氏野村菌产孢的氮源，蛋白胨是最有利于菌落生长的氮源，蚕蛹粉与酵母提取物联合使用对产孢能力有增效作用。最有利于莱氏野村菌产孢的培养基组成为葡萄糖0.4%+酵母提取物1.6%+蚕蛹粉0.4%。

关键词：莱氏野村菌[Nomuraea rileyi （Farlow） Samson]；正交试验；产孢培养基

中图分类号：Q939.95 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）23-6164-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.040

Abstract：The effects of different carbon and nitrogen sources on the cultural characteristics of Nomuraea rileyi were studied， and the best media for the sporulation was screened out. Taking SMAY as basic media， the different cultural characteristics of N. rileyi was compared by replacing different carbon and nitrogen sources， and the best combination of carbon and nitrogen by orthogonal test was screened out. The results showed that different type of carbon source has the different effect on N. rileyi. Monosaccharide is beneficial to the sporulation， while polysaccharide is suitable for the colony growth， and the best carbon source for sporulation is glucose. As nitrogen source， yeast extracts is the best nitrogen to the sporulation， while peptone is good to the colony growth. There is a significant synergism effect when yeast extracts combined with silkworm pupae powder. The best media for the sporulation of N. rileyi is glucose 0.4%+yeast extracts 1.6%+silkworm pupae powder 0.4%.

Key words： Nomuraea rileyi； orthogonal design； cultural media； sporulation

莱氏野村菌[Nomuraea rileyi （Farlow） Samson]是一种全世界广泛分布的昆虫病原真菌（entomopathogenic fungi），对多种农业害虫都有很好的控制作用，尤其对鳞翅目夜蛾科害虫具有更强的寄生能力[1]。相较于另外两种被广泛应用的虫生真菌金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）和球孢白僵菌（Beauveria bassiana），N. rileyi更容易在田间引起害虫疾病的流行，因而在自然环境中经常能发现被莱氏野村菌感染死亡的罹病虫体。在温度、湿度适宜的条件下，N. rileyi可有效降低害虫的种群数量，国外已有多次应用成功的报道[2，3]。相对而言，中国对N. rileyi的开发利用依然较为薄弱。

大部分真菌的研究工作都需要对真菌进行室内人工培养，且不同真菌对培养基的养分组成要求差异较大。培养N. rileyi一般采用萨氏麦芽糖酵母琼脂培养基（Sabouraud maltose agar supplemented yeast extract，SMAY），该种培养基在真菌的菌丝生长、产孢量、产孢速度等方面较为均衡，但生长周期较长，产孢量较低，更换合适的碳源及氮源后，则可以提高产孢速度及产孢量[4]，说明碳源和氮源的选择对N. rileyi的生物学特性有极大的影响。不同的菌株亦可能对碳源和氮源有不同的反应，如适宜莱氏野村菌MZ060806菌落生长的最佳碳源是蔗糖，最佳氮源是水解酪蛋白[5]，适宜Nr16菌落生长的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是酵母浸膏[6]，说明针对不同的菌株，其最优培养基的组成成分有所不同。鉴于此，为了更好地开展对N.rileyi的相关研究，针对一株来源于美国的菌株Nr5772进行了培养基的优化设计及组分筛选。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

莱氏野村菌Nr5772，由美国佛罗里达大学昆虫病理研究室Drion G. Boucias教授提供，接种在SMAY平板培养基上，每隔1个月转接一次，保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2 培养基制备

以SMAY培养基作为基础培养基（麦芽糖1%，酵母浸膏1%，蛋白胨1%，琼脂粉1.2%），分别更换不同的碳源和氮源，制作不同组分的平板，每种平板各做3皿，置于无菌操作室中过夜后接种。

1.2.1 碳源選择 单糖类选择常见的葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖，二糖类选择蔗糖、乳糖、海藻糖，多糖类选择支链淀粉、纤维素、甲壳素，分别替代SMAY中的麦芽糖，含量1%，制作成不同碳源的培养基平板。

1.2.2 氮源选择 SMAY的碳源不变，分别以酵母提取物、蛋白胨、尿素、鱼粉、蚕蛹粉作为氮源，各组分含量均为1%；另设酵母提取物+鱼粉、酵母提取物+蚕蛹粉作为复合氮源，制作成不同氮源的平板，以SMAY培养基作为对照。

1.2.3 碳源和氮源的正交优化设计 试验筛选出最佳的碳源和氮源后，选择3种组分，每种组分含量设置为0.4%、1.0%、1.6%，采用L9（34）正交表进行三因素三水平正交试验，优化培养基组成比例。

1.3 菌落接种及数据测量

将Nr5772孢子粉用含0.1%吐温-80的无菌水稀释成8×106个孢子/mL的孢子悬浮液，用10 μL移液枪垂直接种到平板表面，并尽量使液滴扩散成圆形，每皿接种3滴，各处理接种3皿。接种3 h后移入光照培养箱中恒温培养（25 ℃，L∶D=12∶12），3 d后采用十字交叉法测量各菌斑的直径作为菌落的原始直径，12 d后测量菌落直径的增长情况；15 d时沿菌落边缘取下已产孢的菌落，移入10 mL离心管中，加入5 mL含0.1%吐温-80的无菌水，玻璃棒匀浆后，用血球计数板计量孢子浓度，以此作为产孢量。各处理重复测定3次。试验过程中，每天观察菌落的生长情况，并记录产孢时间。

1.4 数据统计方法

数据采用SPSS软件进行方差分析，正交试验结果采用单变量一般线性模型进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对Nr5772生长的影响

接种后经观察，Nr5772在不同碳源的培养基上生长状况不一样。从表1可以看出，大部分培养基在5 d时已经开始产孢，半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖为碳源的产孢较慢，其中甘露糖为碳源的仅个别菌落边缘有孢子产生，直到12 d时仍未大量产孢。从菌落直径增长率来看，单糖类碳源对Nr5772营养生长的促进作用较弱，增长率在68.70%～146.28%之间；二糖类碳源菌落直径的增长率在165.52%～187.18%之间；多糖类菌落直径的增长率在184.13%～200.00%之间，对营养生长的促进作用最明显。由此可以看出，不同类型的碳源对Nr5772的营养生长效应不同，多糖效果最好，单糖效果最差。从各培养基的产孢量来看，情况正好相反，单糖培养基的产孢能力好于多糖培养基，其中葡萄糖培养基的产孢能力最好，产孢量达4.85×108个孢子/mL，其次是二糖类培养基。Nr5772在不同碳源培养基中的生长状况见图1。

2.2 不同氮源对Nr5772生长的影响

不同氮源对莱氏野村菌Nr5772的生长具有明显不同的效应（表2、图2）。对Nr5772营养生长最有效的氮源是蛋白胨，明显好于酵母提取物，也高于复合氮源鱼粉和蚕蛹粉，与对照SMAY相近；鱼粉对Nr5772营养生长的促进作用最小，但与酵母提取物一起使用时促进作用则大幅提高。从产孢量分析来看，酵母提取物对分生孢子的形成具有明显的促进作用，好于蛋白胨、鱼粉和蚕蛹粉，与对照SMAY相近；鱼粉和蚕蛹粉单独使用时产孢作用较弱，但与酵母提取物联合使用时则可明显提高Nr5772的产孢能力，说明鱼粉、蚕蛹粉与酵母提取物混配有明显的增效作用，尤以蚕蛹粉+酵母提取物的增幅最大，显著高于SMAY的产孢量。各培养基均在5 d后开始产孢，产孢速度与最终的产孢量之间没有明显的相关性。试验中尿素含量设置为1%，未见孢子萌发、菌落生长，说明在此浓度下，尿素对莱氏野村菌孢子具有杀灭作用。

2.3 碳源和氮源的正交优化设计

试验结果表明，对莱氏野村菌Nr5772产孢促进作用最佳的碳源是葡萄糖，最佳的氮源是酵母提取物+蚕蛹粉，在此基础上，采用正交设计对葡萄糖、酵母提取物、蚕蛹粉的含量比例进行试验，以确定最有利于产孢的培养基组成。

从表3可以看出，葡萄糖、酵母提取物和蚕蛹粉不同含量比例对产孢时间没有明显的促进作用，大部分在5 d左右开始产孢。

不同组合的培养基对Nr5772菌落生长影响较小，生长最快的是组合7，即葡萄糖1.6%+酵母提取物0.4%+蚕蛹粉1.6%；对数据进一步进行正交分析，从表4可以看出，酵母提取物第III类平方和最大，表明酵母提取物是对菌落生长促进作用最大的因子，而葡萄糖和蚕蛹粉的作用较小；对葡萄糖、酵母提取物和蚕蛹粉的3个含量水平分别进行方差分析，结果表明葡萄糖与蚕蛹粉含量0.4%、1%、1.6% 3个水平均没有显著差异，酵母提取物含量0.4%处理显著好于1.0%、1.6%处理，说明低含量的酵母提取物有利于菌落的生长。根据方差分析结果，最有利于菌落生长的组合应当为葡萄糖1.6%+酵母提取物0.4%+蚕蛹粉1.6%。

不同含量葡萄糖、酵母提取物和蚕蛹粉对Nr5772产孢能力有明显的影响，产孢量相差较大（表3），效果最好的是组合6，即葡萄糖1.0%+酵母提取物1.6%+蚕蛹粉0.4%。正交分析结果（表4）表明，对产孢能力影响最大的因素是酵母提取物，其次是蚕蛹粉，葡萄糖影响最小，说明氮源对产孢的影响高于碳源。各因素不同水平之间产孢量亦有明显差异，葡萄糖和蚕蛹粉含量0.4%时产孢量最大，随着含量的提高产孢量下降；酵母提取物含量1.6%时产孢量最好。从分析结果来看，葡萄糖0.4%+酵母提取物1.6%+蚕蛹粉0.4%是最佳产孢组合。Nr5772在不同组合培养基中的生长状况见图3。

3 小结与讨论

碳源和氮源是真菌生长过程中必不可少的基本原料，碳源和氮源的种类及含量变化对真菌的生长性状有明显影响。本研究中，多糖类碳源有利于莱氏野村菌Nr5772的营养生长，菌丝生长快，而以单糖作碳源时菌丝生长较慢，此结果与孔琼等[5]的研究相近，与彭小东等[6]的研究有所差异，可能是由于所用的基础培养基不同，兼之培养的时间不同所致。孔琼等[5]、彭小东等[6]的研究证实单糖、二糖有利于产孢，与本研究的结果一致，试验进一步分析了葡萄糖含量对产孢的影响，发现低含量时葡萄糖对产孢的促进作用好于高含量，即在一定范围内，低碳利于产孢，高碳利于菌丝生长，对以收获分生孢子为目的的N. rileyi培养具有一定的实践指导意义。

在供試的几种氮源中，蛋白胨是促进菌落生长最好的物质，菌丝生长量最大，但对真菌的产孢促进作用较小；单独用酵母提取物做氮源时，真菌的产孢能力较好而菌落生长能力较低，因而蛋白胨与酵母提取物混配使用可以优势互补，此结果说明，SMAY作为培养莱氏野村菌的标准培养基，其氮源的构成是合理的。正交试验结果表明，酵母提取物是N. rileyi产孢必不可少的成分，是主要因素。虽然酵母提取物来源于酵母，但如果用酵母粉替代酵母提取物，产孢量则会明显下降[7]，说明提取物中含有刺激产孢的因子。

作为一种昆虫寄生菌，昆虫的组织成分应当是适合N. rileyi生长的天然营养基质，因而在培养基中添加昆虫成分应当有利于真菌生长。基于此种假设，选择中国常见的经济昆虫—蚕，同时也是N. rileyi的天然寄主[8]，把蚕蛹粉作为一种天然的复合氮源添加到培养基中，以测定其对N. rileyi生长的影响。结果与预期一致，蚕蛹粉可以有效增加Nr5772的产孢量，较SMAY培养基产孢效果明显提高，但因蚕蛹粉中含有较多的几丁质等多糖类，添加量不宜过多。鱼粉作为另外一种天然复合有机物，对N. rileyi的促生作用低于蚕蛹粉。总之，以获得分生孢子为主要培养目的时，在培养基中添加蚕蛹粉比较有利。

以上试验结果适于在实验室内进行少量培养时使用，如果要进行大规模培养以获得大量的分生孢子用于田间试验，还需对培养基进行进一步的优化，更改更廉价的碳源和氮源，以方便工业化生产。

本研究探讨了不同碳源和氮源对莱氏野村菌培养性状的影响，发现最有利于该菌产孢的碳源是单糖，氮源是酵母提取物；最有利于菌落生长的碳源是多糖，氮源是蛋白胨；对产孢量起决定作用的因子是酵母提取物，并且与蚕蛹粉联合使用可以提高产孢能力。正交试验结果表明，适合莱氏野村菌产孢的培养基组合为葡萄糖0.4%+酵母提取物1.6%+蚕蛹粉0.4%。

参考文献：

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