数字PCR技术在转基因成分检测中的应用

付海滨，闫超杰，李 姝，刘晓超，张 敏

（1.沈阳检验检疫科学研究院，辽宁沈阳 110016； 2.沈阳出入境检验检疫局技术中心，辽宁沈阳110016； 3.锦州出入境检验检疫局，辽宁锦州 121013； 4.沈阳农业大学，辽宁沈阳 110866）

数字PCR技术在转基因成分检测中的应用

付海滨1，2，闫超杰3，李 姝1，2，刘晓超2，张 敏4

（1.沈阳检验检疫科学研究院，辽宁沈阳 110016； 2.沈阳出入境检验检疫局技术中心，辽宁沈阳110016； 3.锦州出入境检验检疫局，辽宁锦州 121013； 4.沈阳农业大学，辽宁沈阳 110866）

近年来，世界各国都非常重视转基因成分检测技术的研究和应用，因此，建立快速简单、高灵敏度、高精确度的转基因成分检测方法十分必要。数字PCR（digital PCR，dPCR）技术作为一种全新的核酸检测方法，近年来在转基因检测领域备受青睐。文中介绍了数字PCR（digital PCR，dPCR）技术的基本原理，概述了其在转基因成分检测领域的应用进展。

数字PCR；转基因产品；检测方法

自1996年转基因作物被批准商业应用以来，转基因作物的商品化种植得到迅速发展。2014年，全球转基因作物的种植面积为1.815亿hm2，年增长率为3%～4%，比2013年的1.752亿hm2增加了630万hm2（图1所示）［1］。然而，随着全球转基因作物种植面积的不断扩大，转基因产品的种类与数量逐渐增加，转基因作物及其加工食品的安全性的争论迅速席卷全球，使人们对转基因作物及其产品的安全性充满了质疑。随后，各国政府纷纷出台了一系列有关转基因作物及其产品管理的规定和法律法规，很多国家还限定转基因含量达到一定阈值的转基因产品必须进行标识。快速和准确的转基因检测技术是转基因产品安全监管的重要工具，因此，建立快速简单、高灵敏度、高精确度、绝对定量的转基因成分检测方法成为当前研究的热点问题。

目前国内外对转基因作物及其相关制品的检测主要是基于外源蛋白靶标和外源核酸成分的检测来展开的，建立了一系列常见的快速、灵敏的转基因定性和定量检测技术，如酶联免疫吸附技术（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、PCR技术、等温扩增技术（isothermal amplification）和基因芯片技术（gene chip）等，但目前在转基因检测中应用最多的还是基于核酸序列的PCR检测方法［2］。

数字PCR（digital PCR，dPCR）是近年来迅速发展起来的一种全新的核酸检测定量分析技术。与传统PCR技术相比，数字PCR不依赖于扩增曲线的循环阂值（Ct）进行定量，不受扩增效率的影响，也不需要采用内参基因和标准曲线，准确度高、重现性好，可以实现绝对定量分析，dPCR具有高灵敏度、高精确度、高耐受性和绝对定量的优点，该方法在转基因定量分析、物种鉴定、医学诊断、致病微生物定性和定量等领域有较为宽阔的应用前景［3～5］。为此，文中介绍了数字PCR技术的基本原理及其在转基因作物及其产品检测中的应用。

1 数字PCR技术的基本原理

数字PCR（digital PCR，dPCR）的概念最早是由美国科学家Vogelstein等于1999年提出的，即通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元至多包含一个拷贝的目标分子（DNA模板），在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析［6］。数字PCR（也可称单分子PCR）一般包括两部分内容，即PC R扩增和荧光信号分析。在PCR扩增阶段，与传统技术不同，数字PCR一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应，也不同于qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字PCR技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集（图2所示），最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量［7］。

2 数字PCR技术在转基因产品检测中的应用

数字PCR作为更精确和更灵敏的DNA定量检测新技术，实现了单分子DNA的绝对定量，为转基因产品的定量分析提供了新的技术手段。目前商业化的dPCR技术可以分为两大类：微滴式dPCR（droplet dPCR，ddPCR）和芯片式dPCR（chip dPCR，cdPCR）技术［5］。近年来国内外学者不断探索利用数字PCR技术对转基因成分进行精准定量检测研究。在国外，Corbisier等（2010）利用数字PCR分析了玉米种子DNA中外源基因和内标准基因的拷贝数之比，该结果与利用普通荧光定量PCR技术以质粒DNA为标准物质检测的结果相同，证明了数字PCR技术的可靠性［8］。

图1 全球转基因作物种植面积

图2 数宇PCR原理示意图

Burns等（2010）通过Fluidigm数字PCR（Fluidigm chamber dPCR，cdPCR）进行转基因样品含量分析，评估了数字PCR在转基因检测中检测限（LOD）和定量限（LOQ），探索了数字PCR在转基因检测方面的可行性和反应条件，发现该平台灵敏度达到5 copies/assay，表明数字PCR能够准确地对起始模板拷贝数进行绝对定量［9］。Dany等（2013）应用微滴数字PCR技术对食品和饲料中的转基因成分进行了精确定量分析［10］。Song（2015）通过基于QuantStudioTM3D数字PCR平台对转基因大豆进行定量及拷贝数分析，发现与Southern blot及qRT-PCR方法相比数字PCR检测时间更短且具有较好的检测极限［11］。Dobnik等（2015）应用微滴数字PCR技术，建立了针对欧盟授权的12种转基因玉米品系转基因成分多重定量分析方法［12］。Köppel等（2015）建立了基于微滴数字PCR技术的转基因成分快速定量分析方法［13］。

我国数字PCR技术应用起步较晚，近几年很多学者也利用不同的数字PCR技术平台，进行转基因成分检测技术研究。隋志伟等（2013）应用数字PCR技术成功研制了转基因水稻TT51-1标准物质［14］。姜羽等（2014）建立了基于数字PCR技术的转基因成分外源基因拷贝数分析方法［15］。潘广等（2016）基于微滴式数字PCR平台在国内首次建立了转基因玉米品系T25单、双重微滴式数字PCR定量方法，结果表明，所建立的T25品系双重PCR方法能特异性检出转基因玉米T25，而其他转基因玉米、油菜、水稻等作物品系均没有扩增；灵敏度实验数据表明，所建立的T2双重数字PCR方法，在相对标准偏差≤25%时可以检测到4.6个T25特异性边界序列分子，在不考虑各重复间相对标准偏差的情况下可以检测到1个拷贝［16］。任怡菲等（2016）建立了转基因水稻LL62品系特异性数字PCR定量检测方法，对方法的适用性鉴定结果表明，建立的数字PCR方法特异于转基因水稻LL62品系检测［17］；方法可重复性好，准确度高，生成微滴数的RSD值介于0.60%～11.11%之间，小于欧盟定量检测限25%的要求。于晓帆等（2016）建立了使用数字PCR检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定量检测方法，使用数字PCR技术进行定量检测，并确定定量检测的低限，结果表明，数字PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为0.5ng/反应、转基因大豆含量为1%时，相对标准偏差为0.7%［18］。胡佳莹等（2016）基于QuantStudioTM 3D数字PCR平台，以转基因玉米MON863混合样品为例，建立基于单重和双重数字PCR体系的转基因生物（geneticallymodifiedorganisms，GMOs）含量分析方法，与传统qRT-PCR比较发现，在缺乏样品纯度、纯合度信息的情况下，数字PCR能够较好地排除这些因素的影响，测定准确的量值［19］；研究结果表明，QuantStudioTM 3D数字PCR是一种适用于转基因生物含量分析的精确定量方法。姜志军等（2016）利用微滴数宇PCR技术对玉米自交系501幼胚外源基因拷贝数进行了检测分析，成功建立了草甘膦抗性基因G23V-EPSPS在玉米中的遗传转化体系，为以新型高抗草甘膦G23V-EPSPS基因作为转基因玉米筛选标记基因奠定了基础［20］；而且以微滴数宇PCR技术代替传统的Southern Blot简便快速的完成外源基因拷贝数的分析，为微滴数宇PCR技术在转基因外源基因拷贝数检测上的广泛应用做了初步的探索。

3 问题与展望

转基因产品虽然具有诸多优势，但目前并没有完全被人类接受。世界各国对转基因作物及其产品都实行严格的审批和许可制度，世界卫生组织也要求对转基因产品实施标签管理，因此，加强对转基因成分的检测愈发重要，只有准确地检测转基因成分，才能有效的对市场上的转基因食品进行监控。为此，世界上很多国家和地区纷纷加强转基因产品的快速、高通量、精准检测技术研究。近几年数字PCR技术发展迅猛，新技术新方法不断出现，为转基因产品定量检测提供了新方法。全球各大公司对有前景的数字PCR技术竞争激烈，极大地推动了该领域的产业化进程，Bio-Rad、ThermoFisher等厂家相继推出技术较为成熟的数字PCR产品，主要有Bio-rad公司的QX100和QX200微滴式dPCR系统、ThermoFisher公司的QuantStudioTm 3D dPCR系统、Fluidigm公司的Bio-Mark Tm高通量基因分析系统等。

虽然目前数字PCR检测方法多处于研发阶段，还没有真正应用到转基因成分的定量检测中，但其综合了荧光定量PCR的准确性及基因芯片的高通量，并且不依赖标准物质定量，有望成为核酸绝对定量的新标准。因此，今后还需将数字PCR方法与现有的其他转基因检测技术相结合，不断优化数字PCR检测技术，进一步提高数字PCR技术的灵敏度和准确性，特别是制定并形成一批转基因成分数字PCR检测技术标准，在我国转基因产品监管实验室推广应用，为转基因产品的检测和监管提供技术支持。

［1］James C.2014年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势［J］.中国生物工程杂志，2015，35（1）：1～14.

［2］蔡军，李慧，胡梦龙，等.转基因成分分析检测技术研究进展［J］.食品安全质量检测学报，2016，7（2）：706～714.

［3］林彩琴，姚波.数字PCR技术进展［J］.化学进展，2012，24（12）：2415～2423.

［4］丁雄，牟颖.数字核酸扩增检测技术的研究与应用进展［J］.分析化学，2016，44（4）：512～521.

［5］詹成，燕丽，王琳，等.数字PCR技术的发展和应用［J］.复旦学报：医学版，2015，42（6）：786～789.

［6］Vogelstein B，Kinzler KW.Digital PCR［J］.Proc Natl Acads Sci USA.1999，96（16）：9236～9241.

［7］李春勇.数字PCR技术原理及应用［J］.生物技术世界，2014（10）：10～13.

［8］Corbisier P，Bhat S，Partis L，et al.Absolute quantification of genetically modified MON810 maize（Zea mays L.）by digital polymearase chain reaction［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry.2010，396（6）：2143～2150.

［9］Burns M J，Burrell A M，Foy C A.The applicability of digital PCR for the assessment of detection limits in GMO analysis［J］.European Food Research and Technology，2010，231（3）：353～362.

［10］Dany M，Dejan T，Mojca M，et al.Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR［J］.P1oS One，2013，8（5）：e 62583～e62583.

［11］Song L.Application of digital PCR in analyzing transgenic soybeans［C］.Plant and Animal Genome XXIII Conference，Plant and Animal Genome.2015.

［12］Dobnik D，Spilsberg B，Bogožalec Košir A，et al.Multiplex quantification of 12 European Union authorized genetically modified maize lines with droplet digital polymerase chain reaction［J］.Analytical Chemistry，2015，87（16）：8218～8226.

［13］Köppel R，Bucher T.Rapid establishment of droplet digital PCR for quantitative GMO analysis［J］.Eur Food Res Tech，2015，24（3）：1～13.

［14］隋志伟，余笑波，王晶，等.转基因水稻TT51-1标准物质的研制［J］.计量学报，2013，33（5）：67～471.

［15］姜羽，胡佳莹，杨立桃.利用微滴数字PCR分析转基因生物外源基因拷贝数［J］.农业生物技术学报，2014，22（10）：1298～1305.

［16］潘广，章桂明，黄新，等.应用双重数字PCR对转基因玉米成分进行定量方法研究［J］.植物检疫，2016，30（3）：65～71.

［17］任怡菲，高琴，邓婷婷，等.基于数字PCR的转基因水稻LL62品系精准定量检测方法建立［J］.生物技术通报，2016，32（8）：69～76.

［18］于晓帆，高宏伟，孙敏，等.荧光PCR和数字PCR法检测转基因DAS-44406-6品系大豆［J］.食品科学，2016，37（16）：235～241.

［19］胡佳莹，姜羽，杨立桃.利用QuantStudioTM 3D数字PCR分析转基因玉米MON863含量［J］.农业生物技术学报，2016，24（8）：1216～1224.

［20］姜志军，江颖，徐摇光，等.利用微滴数字PCR方法快速分析转基因玉米中外源基因的拷贝数［J］.生物技术进展，2016，6（4）：288～294.

Application of Digital PCR Technology in Detection of Genetically Modified Components

FU Hai-bin1，2，YAN Chao-jie3，LI Shu1，2，LIU Xiao-chao2，ZHANG Min4
（1．Shenyang Academy of Inspection and Quarantine，Shenyang，Liaoning 110016； 2．Technology Center of Shenyang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenyang，Liaoning 110016； 3．Jinzhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Jinzhou，Liaoning 121013； 4．Shenyang Agricultural University，Shenyang，Liaoning 110866）

In recent years，many countries attach great importance to the research and application of the detection technology of genetically modified components.Therefore，it is necessary to establish a rapid，simple，high sensitivity and high precision detection method of transgenic components.Digital PCR（digital，dPCR）technology as a new nucleic acid detection methods，in recent years in the field of transgenic detection favored by the PCR.This paper introduces the basic principle of digital PCR（digital，dPCR）technology，and summarizes its application in the field of genetically modified component detection（PCR）.

Digital PCR；Transgenic product；Test method

S188

B

1002-1728（2017）01-0050-04

10.3969/j.issn.1002-1728.2017.01.012

2017-01-05

沈阳市科技计划项目（F16-104-4-00）

付海滨（1978-），男，博士，高级农艺师，主要从事进出口植物及其产品的检验检疫工作。E-mail：fhbciq@126.com