可见分光光度法在布鲁氏菌病试管凝集试验结果判定中的应用

韩永刚，蒋宏伟，赵光明

（1. 汉台区畜牧兽医技术推广中心，陕西汉中 723000；

2. 陕西省动物疫病预防控制中心，陕西西安 710016）

可见分光光度法在布鲁氏菌病试管凝集试验结果判定中的应用

韩永刚1，蒋宏伟1，赵光明2

（1. 汉台区畜牧兽医技术推广中心，陕西汉中 723000；

2. 陕西省动物疫病预防控制中心，陕西西安 710016）

[目的]研究可见分光光度法在布鲁氏菌病试管凝集试验结果判定中应用。[方法]对布鲁氏菌病虎红平板试验中筛选出的4份样品（样品1、2为阳性，样品3、4为可疑），严格按《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/ T 18646—2002）中的试管凝集试验操作规程，对这4个奶牛样品的试管凝集试验结果进行人工判定和450 /630 nm分光光谱分析判读。[结果]人工判定样品1:100的结果为样品1、2、4可疑或阳性，样品3强阳性，分光光度法判读为样品1、2、4阳性，样品3强阳性。[结论]标准比浊管静置45 min后，各可见光谱数据均具有良好的线性关系；与人工判定结果相比，可见分光光度法判定的结果更直接、客观，受主客观影响因素更少。建议在标准GB/T 18646—2002的试管凝集试验操作规程中，增加可见分光光度法的判读标准。

可见光分光光度法；布鲁氏菌病；试管凝集试验；结果判定

布鲁氏菌病（以下简称布病），也称波状热，是由布鲁氏菌引起的人兽共患传染-变态反应性疾病，属自然疫源性疾病，临床上主要表现为轻重不一的发热、多汗、关节痛等。布鲁氏菌属是一组微小的球杆菌，革兰氏染色阴性，可侵犯人和多种动物。该病不仅影响地区贸易及经济社会发展，更重要的是还可引发公共卫生事件，威胁人类健康，因此我国将其列为二类动物疫病。在国际上，布鲁氏菌被列为二类生物恐怖战剂。长期以来，布病的检测诊断多采用细菌学和血清学方法，目前随着科学技术的发展也出现了分子生物学方法。血清学方法虽然会出现一定的假阳性和假阴性，但其操作简便、试剂稳定性好、易保存、生物风险小，并且有统一的国际判定标准，因而被医疗机构和兽医部门广泛采用，是目前国内布病专业防治机构最常用的检测方法[1]。试管凝集试验（SAT）是一种稳定的、特异性和敏感性较高的检测方法，一直被各国用于人和动物布病的常规血清学诊断，我国将其列为动物布病诊断的标准方法。

范伟兴等[2]研究认为：SAT敏感性高、特异性低，iELISA有高的敏感性，cELISA有高的特异性并能区分自然感染和免疫感染；对未经疫苗免疫而发生布病感染的牛群，用RBT、SAT、iELISA和eELISA检测其血清样品，结果显示这4种试验的阴、阳性检出率基本一致（均在85%以上），但RBT和SAT有较高的假阳性（15%以上）和假阴性（10%以上），iELISA和cELISA的特异性和敏感性均显著高于SAT、RBT；在用RBT和SAT进行检疫时，要用世界动物卫生组织（OIE）推荐的CFT或cELISA进行确诊。

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度，进行定性和定量分析的方法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见分光光度法。它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础[3]。分光光度法具有应用广泛、灵敏度高、选择性好、准确度高、适用浓度范围广、分析成本低、操作简便快速等优点。目前被广泛应用于化工、冶金、地质、医学、食品、制药等行业及环境监测。分光光度测定方法主要包括对照品比较法和吸收系数法。

标准GB/T 18646—2002列出了对动物布病凝集反应结果的判定标准，但均为试验人员以肉眼进行判定，这样易受操作人员技术经验、视力（辨色力）、环境条件、心理等主客观因素影响，从而对结果的判定出现偏差或异议。为提高布病试管凝集试验结果判读的客观性、准确性和判读速度，降低结果的假阳性率和假阴性率，结合可见分光光度法的特点，进行了可见分光光度法判读布病试管凝集试验结果的初步研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Model680酶标仪（滤光片450 nm、490 nm、630 nm）；移液器（大龙1 000～5 000 µL、大龙100～1 000 µL、艾本德20～200 µL ）；电热恒温培养箱；布病凝集试管；空白酶标反应板（可拆卸）。

1.2 材料

1.2.1 试剂。布病试管凝集试验抗原，批号20150703；布病试管凝集试验阳性血清，批号20150702；布病试管凝集试验阴性血清，批号20150903。上述试剂均为青岛易邦公司产品。

1.2.2 被检奶牛血清。共4份，均为日常布病监测筛选出的奶畜血清：样品1（虎红平板试验阳性）、样品2（虎红平板试验阳性）、样品3（虎红平板试验可疑）、样品4（虎红平板试验可疑）。

1.2.3 稀释液。0.5%石炭酸生理盐水（称取0.5 g石炭酸，加入100 mL生理盐水中，121℃高压灭菌30 min）。

1.2.4 抗原、阳性血清和阴性血清。由制标单位提供，按说明书使用。

2 方法

严格按照国家标准《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18646—2002）中的试管凝集试验操作规程进行试验。

2.1 血清的采集和保存

按常规方法采血，分离血清。运送和保存血清样品时，防止冻结或受热，以免影响凝集价。若3 d内不能送到实验室，按每9 mL血清加1 mL 5%石炭酸生理盐水（缓缓加入）的标准防腐，也可用冷藏方法运送血清。

2.2 血清的稀释

每份血清用4支凝集试管。第1管，标记检验编码后，加1.20 mL稀释液；第2～4管，各加入0.5 mL稀释液。然后用20～200 µL移液器吸取被检血清0.05 mL，加入第1管内，混合均匀。混合方法是将该试管中的混合液吸人吸管内，再沿试管壁吹入试管中，如此重复3～4次。充分混匀后，用该移液器吸混合液0.25 mL弃去，再用100～1 000 µL移液器取0.5 mL混合液加入第2管。用该移液器如前述方法混合，再吸第2管混合液0.5 mL至第3管，如此倍比稀释至第4管，从第4管弃去混匀液0.5 mL。稀释完毕后，第1～4管的血清稀释度分别为1:25、1:50、1:100和1:200。将0.5 mL 20倍稀释的抗原，加入已稀释好的各血清管中，振摇均匀，被检血清稀释度则依次变为1:50、1:100、1:200和1:400。置37～40 ℃ 温箱24 h，取出检查并记录结果。大规模检疫时也可只用2个稀释度，即牛、马、鹿、骆驼用1:50和1:100。每次试验均设阳性血清、阴性血清和抗原对照。阴性血清对照：阴性血清的稀释和加抗原方法与受检血清相同；阳性血清对照：阳性血清须稀释到原有滴度，加抗原的方法与受检血清相同；抗原对照：1:20稀释抗原液0.5 mL，再加0.5 mL稀释液，观察抗原是否有自凝现象。

2.3 结果的判定

严格参照国家标准《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18646—2002）中的试验结果判定标准，进行准确判定并登记。

3 结果

3.1 标准试验结果

在标准实验中，样品1、2、3、4的虎红平板试验结果分别为阳性、阳性、可疑、可疑，阳性血清结果为强阳性；样品1、2、3、4的试管凝集试验（1:100、1:50）综合判定结果分别为阳性、可疑或阳性、强阳性、阳性或可疑，阳性血清结果为强阳性。以上试验所有阴性血清试验结果均为阴性（表1）。

表1 布病国家标准试验结果统计

3.2 标准比浊管可见分光光度法扫描结果

根据分光光度法原理，Model680酶标仪（滤光片450 nm、490 nm、630 nm）检测光谱在400～760 nm可见光范围内。参考酶联免疫吸附试验操作技术，将配置好的比浊管溶液、样品试管凝集试验管溶液、抗原对照试验管溶液各200 µL，加入已标记好的空白酶联反应板孔内，送入Model680酶标仪进行光谱扫描读数，并分别统计。为研究比浊管光谱扫描数据的线性关系以及与光谱的相关性，分别采用450/490/630 nm光谱进行试验分析。为了简化试验操作以及研究时间对光谱扫描数据和试验结果的影响，分别采用450 nm扫描2次（间隔15 min）和630 nm扫描1次的数据，进行结果判定研究，数据见表2、表3。

表2 标准比浊管可见分光光度法扫描结果分析

表3 可见光分光光度法布病试管凝集实验扫描结果统计

3.3 标准比浊管光谱线性分析

对标准比浊管配液，以1:20抗原，分别按75%、50%、25%、0浓度进行配制。△值以0浓度光谱值为基数，按公式“△值=（被检光谱值-0浓度光谱值）/75%光谱值”计算得出，并分析相应时间与溶液浓度的线性关系。标准比浊管配液静置45 min后，溶液浓度与可见光光谱450 nm、490 nm、630 nm处扫描值均具有良好的线性相关，说明可见光分光光度法完全适用于试管凝集试验结果的比较判定（图1、图2）。

图1 配液后10 min内标准比浊管可见光分光光度分析

图2 配液45 min后标准比浊管可见光分光光度分析

4 样品结果分析

分析比较同等条件下，用可见分光光度法450 nm扫描2次（间隔15 min）及630 nm扫描1次，对试验结果判定的影响。判定标准为：50%浓度比浊管数值＜检测数值≤75%浓度比浊管数值，判为“﹢”；25%浓度比浊管数值＜检测数值≤50%浓度比浊管数值，判为“﹢﹢”；0浓度比浊管数值＜检测数值≤25%浓度比浊管数值，判为“﹢﹢﹢”。

4.1 样品1的光谱结果分析

对1:50和1:100稀释度可见分光光度法450 nm扫描2次（间隔15 min）（图3）及630 m扫描1次的试验数据（图4），按标准均判定为“﹢﹢”，综合判定1:50为“﹢﹢”，1:100为“﹢﹢”，布病试管凝集试验阳性。

4.2 样品2的光谱结果分析

对1:50和1:100稀释度可见分光光度法450 nm扫描2次（间隔15 min）（图5）及630 nm扫描1次的试验数据（图6），按标准判定1:50为“﹢﹢﹢”，1:100为“﹢﹢”，综合判定1:50为“﹢﹢﹢”，1:100为“﹢﹢”，布病试管凝集试验阳性。

图3 1:50和1:100稀释度可见分光光度法450 nm扫描结果（样品1）

图4 1:50和1:100稀释度可见分光光度法630 nm扫描结果（样品1）

图5 1:50和1:100稀释度可见分光光度法450 nm扫描结果（样品2）

图6 1:50和1:100稀释度可见分光光度法630 nm扫描结果（样品2）

4.3 样品3的光谱结果分析

对1:50和1:100稀释度可见分光光度法450 nm扫描2次（间隔15 min）（图7）及630 nm扫描1次试验数据（图8），按标准判定为“﹢﹢﹢”，综合判定1:50为“﹢﹢﹢”，1:100为“﹢﹢﹢”，布病试管凝集试验阳性。

图7 1:50和1:100稀释度可见分光光度法450 nm扫描结果（样品3）

图8 1:50和1:100稀释度可见分光光度法630 nm扫描结果（样品3）

4.4 样品4的光谱结果分析

对1:50和1:100稀释度可见分光光度法450 nm扫描2次（间隔15 min）（图9）及630 nm扫描1次的试验数据（图10），按标准分别判定为“﹢﹢﹢”“﹢﹢”，综合判定1:50为“﹢﹢﹢”，1:100为“﹢﹢”，布病试管凝集试验阳性。

图9 1:50和1:100稀释度可见分光光度法450 nm扫描结果（样品4）

图10 1:50和1:100稀释度可见分光光度法630 nm扫描结果（样品4）

4.5 试管凝集试验人工判读与可见光光度法判读结果对比

对比样品2、样品4的1:100稀释度人工和可见分光光度法判读结果，可以看出对部分样品试验结果，由于试验人员自身视力条件（视力、辨色力等）或技术经验等影响出现判定差异（表4）。在样品无法长期保存的情况下，人工判读对试验结果无法获得客观上的统一，存在分歧。而分光光度法通过光学扫描数据对比，有效消除了对试验结果判定的分歧，并且试验数据可长期保存并随时可查阅比对。

表4 布病试管凝集试验人工与光度法判读结果统计对比

5 结论与建议

通过对标准比浊管分光光度法扫描结果进行分析发现，只有标准比浊管配置完成后静置45 min以上，标准比浊管可见光分光光度值才能体现较好的线性关系，此后才能作为试管凝集试验的评判标准。

由布病试管凝集试验结果可见，与人工判读结果相比，可见光分光光度法得出的结论更加客观、直接、准确，不易受试验人员主客观因素影响和干扰，且可见光谱范围内各光谱得出的检测结果相一致，说明试验重复性好，结果不受时间影响。

建议对布病试管凝集试验（SAT）结果可见分光光度法判定方法进行深入研究，并在国家标准《动物布鲁氏菌病的诊断技术》（GB/T 18646—2002）中增加试管凝集试验操作规程可见分光光度法判读标准。

[1] 刘志国，任清华，王妙，等. 布病特异性血清学检测技术应用概述[J]. 中国人畜共患病学报，2013，29（10）：1026-1031.

[2] 范伟兴，钟旗，何倩倪，等. 几种布鲁氏菌病血清学诊断方法的比较研究[J]. 中国动物检疫，2006，23（6）：31-32.

[3] 严拯宇. 分析化学：紫外-可见分光光度法[M]. 南京：东南大学出版社，2005.

（责任编辑：朱迪国）

Application of Visible Spectrophotometry in Result Determination of Tube Agglutination Test for Brucellosis

Han Yonggang1，Jiang Hongwei1，Zhao Guangming2
（1. Hantai District Animal Husbandry and Veterinary Technology Promotion Center，Hanzhong，Shaanxi 723000；2. Shaanxi Animal Disease Prevention and Control Center，Xi'an，Shaanxi 710016）

[Objective] In order to study the application of visible spectrophotometry in determining the results of tube agglutination test for brucellosis. [Methods] 4 samples consisting of 2 positive（sample 1，2）and 2 suspicious（sample 3，4）were selected by rose bengal plate test（RBPT）of brucellosis，then tube agglutination test was conducted towards the samples in strict accordance with the operating procedures from Diagnostic Techniques for Brucellosis of Animal（GB/T 18646—2002）. At last，results were determined by both manual judgment and 450/630 nm spectroscopic analysis. [Results] For manual judgment（dilution ratio of 1:100），sample 1，2 and 4 were suspicious or positive，sample 3 was strongly positive. For spectroscopic analysis，results showed sample 1，2 and 4 were positive and sample 4 was strongly positive. [Conclusion] After 45 minutes' standing of the standard turbidimetric tube，visible spectrum data exhibited a good linear relationship. Hence，compared with manual judgment，results determined by visible spectrophotometry were more visualized and objective，affecting less influence of subjective and objective factors. It was recommended that assessment criteria should be added to the operation procedures according to the national standard of GB/T 18646—2002.

visible spectrophotometry；brucellosis；tube agglutination test；result determination

S851.34

B

1005-944X（2017）03-0082-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.03.022