复方芪鹰颗粒对糖尿病周围神经病变大鼠Hsp70表达的影响

刘涛+卢军+石莹莹

[摘要] 目的 觀察复方芪鹰颗粒对糖尿病周围神经病变（DPN）大鼠坐骨神经Hsp70表达及坐骨神经损伤纤维的影响，探讨其机制。 方法 从60只Wistar大鼠中随机取出10只为正常组，50只大鼠造DPN模型，将成模43只大鼠随机分为模型组（11只）、复方芪鹰颗粒低剂量组（11只）、复方芪鹰颗粒中剂量组（11只）、复方芪鹰颗粒高剂量组（10只），实验过程中，模型组死亡3只，复方芪鹰颗粒低剂量组死亡1只。复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组分别为1.17、2.34、4.68 g/kg，模型组、正常组均灌以相应容积的蒸馏水，1次/d。治疗4周后，观察各组Hsp70表达、坐骨神经损伤纤维变化。 结果 复方芪鹰颗粒各剂量组及模型组坐骨神经中Hsp70表达与正常组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；复方芪鹰颗粒中、高剂量组坐骨神经中Hsp70表达与模型组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），而中剂量及高剂量组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）；复方芪鹰颗粒各剂量组及模型组与正常组在在坐骨神经损伤纤维百分比方面比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组与模型组在坐骨神经损伤纤维百分比方面比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 复方芪鹰颗粒可能通过调节DPN大鼠坐骨神经Hsp70水平，从而改善受损坐骨神经。

[关键词] 复方芪鹰颗粒；中药复方；糖尿病周围神经病变；Hsp70

[中图分类号] R259 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）01（a）-0028-04

[Abstract] Objective To observe the effect of Compound Qiying Granule on the expression of Hsp70 and the injury of sciatic nerve in sciatic nerve of rats with diabetic peripheral neuropathy （DPN） and explore its mechanism. Methods From 60 Wistar rats， 10 rats were taken randomly as normal group， 50 rats were made DPN model， the model of 43 rats were randomly divided into model group （n=11）， low dose group of Compound Qiying Granule （n=11）， medium dose group of Compound Qiying Granule （n=11）， high dose group of Compound Qiying Granule （n=10）， in the course of the experiment， 3 rats died in the model group，1 rat died in low dose group of Compound Qiying Granule. The dose of low， middle and high group were 1.17， 2.34 and 4.68 g/kg respectively. Normal and model groups were given equal volume of distilled water once daily. After 4 weeks treatment， the expression of Hsp70 and the change of sciatic nerve fiber damage were observed. Results The expression of Hsp70 in each dose Compound Qiying Granule group and model group compared with the normal group， the difference was statistically significant （P < 0.01）； the expression of Hsp70 in medium and high dose groups of Compound Qiying Granule compared with the model group， the difference was statistically significant respectively （P < 0.01）， and had no significant difference between medium dose and high dose group （P > 0.05）. The sciatic nerve fiber percentage in each dose Compound Qiying Granule group and model group compared with the normal group， the difference was statistically significant （P < 0.01）； the sciatic nerve fiber percentage in low， medium and high dose group of Compound Qiying Granule compared with the model group， the difference was statistically significant （P < 0.01）. Conclusion The Compound Qiying Granule can improve the Hsp70 of sciatic nerve in DPN rats and improve the injured sciatic nerve.

[Key words] Compound Qiying Granule； Chinese herbal formula； DPN； Hsp70

糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病的常见并发症，与周围神经轴突萎缩、脱髓鞘、再生障碍以及神经纤维的减少有关[1-2]，其确切发病机制尚不完全清楚[3]。Yorek[4]认为，DPN是一种常见的以神经退行性病变为特点的糖尿病并发症，多种病理机制参与致病，所以很难单一用药物控制。研究发现，调节分子伴侣Hsp70活性的药物能够通过提高DPN的感觉功能、综合电生理、生化和形态指标等方面来达到广泛的细胞保护作用[5]。复方芪鹰颗粒作为新疆维吾尔自治区中医医院（以下简称“我院”）院内制剂，被广泛应用于DPN的治疗中。前期实验及临床研究显示，该药能加快感觉及运动神经传导速度，升高血清中血管内皮生长因子水平，降低血清同型半胱氨酸水平，增加Na+/K+-ATP酶的活性及胰岛素样生长因子-1水平等多方面的作用，从而减轻患者临床症状[6-11]。因此，基于该药的多靶点特性，本课题通过研究复方芪鹰颗粒对DPN大鼠分子伴侣Hsp70调节，揭示其对DPN的治疗途径与作用靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄SPF级雄性Wistar大鼠60只，体重130～170 g，由新疆维吾尔自治区疾病控制中心提供。许可证号SCXK新2005-006。

1.2 实验药物

复方芪鹰颗粒，由我院研制，批号ZJ2012006。

1.3 主要试剂与仪器

链脲佐菌素（STZ）购于Sigma公司、Hsp70抗体（Sigma公司），SP-9000免疫組化试剂及DAB显色剂（中杉金桥）、PBS、TBS缓冲液（Boster公司）。石蜡切片机（Rm-2135型，德国Leica公司）；光学显微镜，CX21型，日本奥林巴斯公司。显微成像系统，DM-500，德国莱卡公司。血糖仪，4297A型，台湾博士医生。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型

1.4.1.1 2型糖尿病模型 造模过程参考本课题组前期工作[11]。造模大鼠持续喂以高脂饲料（其中含70%碳水化合物、20%蔗糖，10%猪油）8周。8周后，大鼠禁食14 h后腹腔注射小剂量STZ 35 mg/kg（STZ溶于0.1 mol/L，pH=4.5的枸橼酸缓冲液，配制为1%的溶液）进行造模。之后监测大鼠空腹血糖，选取空腹血糖高于11.1 mol/L的大鼠作为糖尿病模型大鼠。

为防止糖尿病大鼠因血糖过高而无法存活至实验终点，根据所测得的血糖水平予以精蛋白锌胰岛素注射液1～4 U，1 次/d，皮下注射，维持血糖在20.0～25.0 mmol/L（糖尿病组及各治疗组均有此情况）。

1.4.1.2 DPN大鼠模型 在2型糖尿病大鼠的基础上继续高脂饮食4周，之后应用Meditronic keypoint-4 workstation肌电图仪测定糖尿病大鼠下肢坐骨神经的感觉和运动传导速度，糖尿病大鼠造模成功后测定感觉或运动传导速度减慢超过11%，即可判定为成功的DPN大鼠模型[12-13]。

1.4.2 分组与给药

从60只8周龄大鼠中随机取10只为正常组；50只造模，造模成功43只，随机分为4组：模型组（11只）、复方芪鹰颗粒低剂量组（11只）、复方芪鹰颗粒中剂量组（11只）、复方芪鹰颗粒高剂量组（10只）。

复方芪鹰颗粒治疗组（1.17、2.34、4.68 g/kg，用纯水分别配为8.45%、16.9%、33.8%的溶液），模型组、正常组均灌以相应容积的蒸馏水，1次/d，每次2 mL灌胃。连续用药4周，实验期间全部大鼠予普通饲料喂养，自由进食和水。

1.4.3 留取标本

所有实验大鼠均在用药4周后处死。将大鼠予10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，俯卧位固定于手术台上。开腹、开胸暴露心脏，将针头经心尖处插进左心室，剪开右心耳，给予37℃生理盐水灌流，直至流出液无色为止。继续给予4℃、4%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合固定液40 mL左右灌流固定，直至大鼠身体变硬为止。固定脊椎，于股骨干后外侧剪开股二头肌与半膜肌之间的皮肤，于大鼠股外侧肌间隙进入，并沿两股间钝性分离，暴露坐骨神经，沿坐骨神经向腰椎内将神经用力拉出，找到膨大的背根神经节，用锐利刀片切取神经节组织，留取坐骨结节至远端胫腓神经分叉处的坐骨神经。将组织置于冻存管内，-80°冻存，备用。

1.4.4 检测指标

1.4.4.1 Hsp70表达测定 Hsp70的免疫组化及平均光密度测定参考文献[14-15]。

1.4.4.2 大鼠坐骨神经损伤纤维 取大鼠左侧从坐骨结节至远端胫腓神经分叉处的坐骨神经，4%甲醛固定，并逐级酒精脱水，12 h后取出，蜡块包埋，切片，Kullshitzky髓鞘染色法染色，用光镜观察坐骨神经髓鞘的病理变化及药物的影响。在每一神经标本纵切片上观察25根有髓神经纤维，计数发生神经病变（结周脱髓鞘、磷脂过度皱褶、结间隙增多、节段性脱髓鞘、髓鞘发生溃变/Wallerian变性）的纤维，计算其占总纤维数的百分率。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，各组实验数据用均数±标准差表示，方差齐时采用t检验；方差不齐时用秩和检验。检验水准α=0.05，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况

正常组大鼠的一般状况良好，模型组大鼠出现消瘦、多食、多尿症状，各治疗组大鼠在实验过程中，症状均较模型组大鼠轻。在实验期间，模型组死亡3只，复方芪鹰颗粒小剂量组死亡1只。

2.2 各组坐骨神经Hsp70表达水平的比较

复方芪鹰颗粒各剂量组及模型组大鼠坐骨神经Hsp70表达与正常组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；复方芪鹰颗粒中、高剂量组大鼠坐骨神经Hsp70表达与模型组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），而复方芪鹰颗粒中剂量及复方芪鹰颗粒高剂量组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.3复方芪鹰颗粒对大鼠坐骨神经损伤神经纤维的影响

复方芪鹰颗粒各剂量组及模型组坐骨神经损伤纤维百分比与正常组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组坐骨神经损伤纤维百分比与模型组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。

3 讨论

Hsp70是一个重要的神经保护分子伴侣，其蛋白结构主要包括一个N端约450个氨基酸残基的高度保守的ATPase功能域和一个C端约200个氨基酸残基的相对保守的区域（肽链结合区），主要是通过帮助蛋白质复性的作用机制，减少神经退行性疾病[16]。在应激条件下，Hsp70可快速转移至细胞核、核仁等附近区域，并可经细胞质进入细胞核，与变性蛋白疏水区结合，限制其相互聚合并解聚已聚合蛋白，恢复正常三级结构。研究表明，Hsp70主要通过抑制炎症信号通路（核因子-κB）而抑制脑内炎症反应，从而发挥保护神经元的作用[17]。尽管DPN的病因没有与某一个特定的错误折叠或聚集蛋白聚合相关，高血糖会增加氧化应激，氨基酸的氧化修饰，可妨碍蛋白质折叠，降低线粒体功能和蛋白导入，增强与分子伴侣的相互作用[18-19]。分子伴侣的调节可以改善DPN中因营养受损的周围神经的胰岛素信号[20]。因此，调节分子伴侣Hsp70对于治疗DPN有重要作用。

复方芪鹰颗粒是胡晓灵主任医师根據中医理论，结合DPN的特点，长期应用于临床，疗效显著[6-10]。它是以消渴为本，痿痹为标，以气阴两虚、痰瘀阻滞、风伏络瘀为根本病机，以益气养阴、祛瘀化痰、疏风通络为法组方，精选黄芪、黄精、鹰嘴豆、丹参、蝉蜕五味中药。君药黄芪甘而微温，归脾肺经，功擅补中益气健脾，向为补气之主将。《别录》谓其“补丈夫虚损，五劳赢瘦，止渴”；《日华子本草》称其可“助气，壮筋骨，长肉，补血”。由是观之，黄芪之补气，本可生津以疗消渴，亦可养血生肌壮筋以起痿症，又能祛风调营达卫而治痹症。臣药黄精甘平，归脾肺肾经，功可补气养阴，健脾润肺益肾。《日华子本草》称之可“补五劳七伤，助筋骨，生肌，耐寒暑，益脾胃，润心肺”；《本草纲目》谓其“补诸虚……填精髓”。本品不仅能补益肺肾之阴，而且能补益脾气脾阴，常与黄芪合用，治疗气虚津亏之消渴。臣药鹰嘴豆性味甘平，无毒，具有补中益气、温肾壮阳、活血解毒、润肺止咳等作用。维吾尔语称之为“诺胡提”，在阿维森纳《医典》及《膳食正要》《本草拾遗》等典籍中均有记述，是药食兼用珍品。本方选用鹰嘴豆，一者与黄精相伍，协助君药，共奏补中益气之功，用作臣药；两者与丹参相合，助其通行血脉之力，兼充佐药之职。佐药丹参苦微寒，归心肝心包经，功可活血祛瘀止痛，凉血消痈，除烦安神。本品善能通行血脉，祛瘀止痛，广泛应用于各种瘀血病证。因其性偏寒凉，对血热瘀滞之证尤为相宜。佐药蝉蜕甘寒，归肺肝经，功可疏散风热，息风止痉。《本草纲目》谓其“治头风眩运，皮肤风热，痘疹作痒，破伤风及疔肿毒疮，大人失音，小儿噤风天吊，惊哭夜啼，阴肿”。本品甘寒入肺经，可祛肺经风热，入肝经，可通络止痉。《外科正宗》消风散治风湿浸淫肌肤血脉，皮肤瘙痒，即用本品疏散肌肤风邪。复方芪鹰颗粒取蝉蜕为佐药，盖以消渴痿痹风邪伏于四肢肌肤络脉之内，非轻清疏达之品不办，蝉蜕性能功治，正可当之。现代药理研究发现，黄精、黄芪、丹参、蝉衣、鹰嘴豆对本病均有一定的治疗作用。

本实验研究发现，复方芪鹰颗粒中、高剂量组与模型组在大鼠坐骨神经的Hsp70表达方面比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），而中剂量及高剂量间比较差异无统计学意义（P > 0.05），提示复方芪鹰颗粒能够提高Hsp70的水平。而对于坐骨神经损伤纤维的影响，复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组与模型组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），提示复方芪鹰颗粒具有减少坐骨神经损伤纤维作用，其原因可能与该药能够提高Hsp70的表达有关。Hsp70的表达上调能够防止神经细胞凋亡[21]，减少神经退行性疾病的氧化应激反应[22]。最近研究支持Hsp70的表达可以通过加速c-Jun的蛋白酶体降解，防止神经调节蛋白1（NRG1）诱导周围神经的脱髓鞘[23]。而Kirkegaard等[24]报道，Hsp70可通过稳定溶酶体膜，阻止溶酶体蛋白酶释放入胞浆，从而抑制经溶酶体通路诱导的细胞凋亡。因此，Hsp70对于神经的保护不仅因为分子伴侣的作用，还有其抑制凋亡的作用。该药物具体机制可能是高表达的Hsp70帮助受损周围神经细胞中错误蛋白质的折叠发挥了分子伴侣的作用，改善了线粒体功能，阻止了细胞凋亡，修复了受损的周围神经的胰岛素信号传导[18-19]，防止了周围神经轴突萎缩、脱髓鞘、再生障碍，从而达到治疗DPN的目的。

[参考文献]

[1] Farmer KL，Li C，Dobrowsky RT. Diabetic peripheral neuropathy：should a chaperone accompany our therapeutic approach？ [J]. Pharmacol Rev，2012，64（4）：880-900.

[2] Vinik AI，Shapiro DY，Rauschkolb C，et al. A randomized withdrawal，placebo-controlled study evaluating the efficacy and tolerability of tapentadol extended release in patients with chronic painful diabetic peripheral neuropathy [J]. Diabetes Care，2014，37（8）：2302-2309.

[3] 赵步长，赵涛，赵明中.糖尿病周围神经病变的发病机制及中药木丹颗粒干预研究新进展[J].中国医药导报，2013， 10（12）：33-35.

[4] Yorek MA. Treatment of diabetic neuropathy with baicalein：intervention at multiple sites [J]. Exp Neurol，2011，232（2）：105-109.

[5] Urban MJ，Pan P，Farmer KL，et al. Modulating molecular chaperones improves sensory fiber recovery and mitochondrial function in diabetic peripheral neuropathy [J]. Exp Neurol，2012，235（1）：388-396.

[6] 吴健勇，陈宇.复方芪鹰颗粒联合α-硫辛酸对糖尿病周围神经病变的疗效及胰岛素样生长因子-1的影响[J].中国药业， 2014，23（24）：31-33.

[7] 高华，胡晓灵.复方芪鹰颗粒对DPN患者同型半胱氨酸的影响及临床疗效观察[J].内蒙古中医药，2008，26（2）：2-5.

[8] 庄晓芳，胡晓灵.复方芪鹰颗粒对DPN患者血管内皮生长因子的影响及临床疗效观察[J].科技导报，2009，27（12）：23-27.

[9] 张文佳，胡晓灵.复方芪鹰颗粒对DPN患者胰岛素样生长因子-1影响的临床研究[J].山西中医杂志，2010，26（3）：17-19.

[10] 梁健.复方芪鹰颗粒在糖尿病周围神经病变中的临床应用研究[D].乌鲁木齐：新疆医科大学，2011：1-21.

[11] 马丽，胡晓灵.络必通颗粒对DPN大鼠神经电生理及Na+-K+-ATP酶活性的影响[J].中成药，2010，32（9）：1587-1589.

[12] Johnsen B，Fuglsang-Frederiksen A. Electrodiagnosis of polyneuropathy [J]. Neurophysiol Clin，2000，30（6）：339-351.

[13] Wu PB，Gussner CG，Date ES. Correlation of EMG，CMAP and SNAP amplitude decrease in mononeuropathies with axonal loss [J]. Electromyogr Clin Neurophysiol，1996，36（7）：405-409.

[14] 丁乐，张泓，张娟，等.子午流注结合常规针刺法对胃黏膜损伤家兔褪黑素及HSP70的影响[J].中医药导报，2013，19（3）：9-12.

[15] 粟艳梅，张泓，张雨辰，等.艾灸对脾虚胃溃疡模型大鼠MT及HSP70影响[J].辽宁中医药大学学报，2015，17（1）：80-83.

[16] Bienemann AS，Lee YB，Howarth J，et al. Hsp70 suppresses apoptosis in sympathetic neurones by preventing the activation of c-Jun [J]. J Neurochem，2008，104（1）：271-278.

[17] Sheppard PW，Sun X，Khammash M，et al. Overexpression of heat shock protein 72 attenuates NF-κB activation using a combination of regulatory mechanisms in microglia [J]. PLoS Comput Biol，2014，10（2）：e1003471.

[18] Baseler WA，Dabkowski ER，Williamson CL，et al. Proteomic alterations of distinct mitochondrial subpopulations in the type 1 diabet heart：Contribution of protein import dysfunction [J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2011，300（2）：R186-R200.

[19] Pratt WB，Morishima Y，Peng HM，et al. Proposal for a role of the hsp90/hsp70-based chaperone machinery in making triage decisions when proteins undergo oxidative and toxic damage [J]. Exp Biol Med，2010，235（3）：278-289.

[20] Urban MJ，Dobrowsky RT，Blagg BS. Heat shock response and insulin-associated neurodegeneration [J]. Trends Pharmacol Sci，2012，33（3）：129-137.

[21] Bienemann AS，Lee YB，Howarth J，et al. Hsp70 suppresses apoptosis in sympathetic neurones by preventing the activation of c-jun [J]. J Neurochem，2008，104（1）：271-278.

[22] Chaudhury S，Welch TR，Blagg BS. Hsp90 as a target for drug development [J]. Chem Med Chem，2006，1（12）：1331-1340.

[23] Li C，Ma J，Zhao H，et al. Induction of heat shock protein 70（Hsp70） prevents neuregulin-induced demyelination by enhancing the proteasomal clearance of c-Jun [J]. ASN Neuro，2012，4（7）：425-437.

[24] Kirkegaard T，Roth AG，Petersen NH，et al. Hsp70 stabilizes lysosomes and reverts Niemann-Pick disease-associated lysosomal pathology [J]. Nature，2010，463（7280）：549-553.

（收稿日期：2016-09-16 本文編辑：王红双）