稀有鮈鲫作为水生模式生物的研究及探讨

吴晟旻，张圣虎，吉贵祥，刘济宁，石利利,*，周炳升

1. 环境保护部南京环境科学研究所，南京 210042 2. 中国科学院水生生物研究所，武汉 430072 3. 中国科学院大学，北京 100049

稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus Ye et Fu, 1983年)属鲤科，鮈鲫属，较广泛地分布于我国四川省的成都平原及其西部边缘地区，涉及岷江中游、沱江上游、大渡河中下游和青衣江中下游，是我国特有的小型鱼类。稀有鮈鲫体型小、饲养简便、卵膜透明、可周年产卵，符合水生模式生物培养对象的必要条件。本文旨在通过研究与分析，认知稀有鮈鲫与国际公认模式生物存在的差距，借鉴发达国家推动模式生物的实践经验，为稀有鮈鲫成为水生模式生物找到一条切实可行的途径。

1 稀有鮈鲫作为水生模式生物的意义(Significance of rare minnow as an aquatic model organism)

1.1 模式生物基本概念

模式生物(model organism)，其定义为一种动物由于其生物学特性，被认为能代表一个更大的生物群体，同时这种动物身上的其他特点使它更容易或更方便用于所代表动物的科学研究，从而成为模式生物。常见的模式生物有果蝇、爪蟾、斑马鱼、小鼠等。模式生物应具有以下几种或全部特点[1-3]：

(1) 物种自身结构包含了所代表生物类群的基本生物学过程；(2) 野外获取容易，易于在实验室条件下饲养繁殖；(3) 具有相对小而稳定的基因组；(4) 生命周期短；(5) 研究方便和操作简单；(6) 易于开展遗传学分析；(7) 品系资源丰富(野生、突变、转基因等品系)。

上述条件的第(1)、(2)、(3)、(4)条，有不少物种可以达到要求，但是第(5)、(6)、(7)条则需要通过长期的科研实践和科技人员坚持不懈的努力才能达到。

1.2 模式鱼种选择

鱼类作为模式生物已经有近200年的历史[4]。有记载最早使用的鱼种是金鱼，在19世纪中期欧洲将其用于水生毒理学研究[5]。随着研究领域的扩大，鱼种的选择也在不断丰富。目前常用鱼类开展研究的领域有发育学、遗传学、免疫学、毒理学、癌症、基因组、转录组学等。试验鱼种的选择也开始多样化。然而研究用鱼并不是科研人员随便确定或随机获得的，而是经过多年研究和反复选择而得。近30年来，有不少鱼种曾一度被认为是优良模式生物，但随着研究深入发现了许多限制条件而逐渐淘汰。例如，河豚鱼由于其基因组大小只有300～400 Mb(为人类基因组的1/8左右)，但基因数目却与人大致相当，被认为是十分理想的模式生物[6]，但由于在实验室条件下繁殖养育困难，而逐渐褪去了模式生物的光环[7]。还有我国最常见的四大家鱼，青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼。这些鱼在我国分布广泛，养殖和繁育也较为容易。但是由于它们体型大、性成熟周期长(3～5年)，也不适用模式生物[8]。因此，经过多年的选择和淘汰后，目前最常用的试验鱼种有斑马鱼(Danio rerio)、青鳉(Oryzias latipes)、虹鳟(Salmo gairdneri)、黑头软口鲦(Pimephales promelas)、金鱼(Carassius auratus)和稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)等。图1是4种常用鱼种在部分学术领域发表文献的数量情况。

图1 4种常用鱼种在部分学术领域发表文献数量(截至2017年2月20日)Fig. 1 Number of publications in part of academic fields regarding some of commonly used fish species (until Feb. 20, 2017)

图1结果显示，从文献总量来看，斑马鱼的文献总量最为丰富，并远大于其他3种鱼文献量的总和，4种鱼文献数量大小依次为斑马鱼>青鳉>金鱼>稀有鮈鲫。从研究领域来看，斑马鱼在几乎所有领域均是常见的研究鱼种，金鱼在研究氧化胁迫、免疫等领域[9-10]使用较多。青鳉在发育、遗传等领域产出文献较为丰富[11-12]。而稀有鮈鲫则在毒理学和发育领域研究相对较多[8,13]。此外，4种鱼在发育、生长和繁殖这几个涉及鱼类基本生物学过程的领域加和产出的文献数量约占文献总量的50%，提示基本生物学过程研究是成为模式生物的重要基础。

1.3 稀有鮈鲫作为水生模式生物的意义

我国是化学品研发、生产、使用和出口大国。各类化学品广泛应用于我国生产和生活的各个领域，并通过多种途径大量释放进入环境[14]。鱼类是水生态测试重要的受试生物，也是生态系统重要指示生物[15]。由于生态系统的敏感种和优势种具有非常强的地域特性[16]，使用我国本土鱼种会比国际通用物种或西方典型鱼种更能真实地反映化学品对我国本土生态系统的影响。另外，欧盟REACH法规规定所有在欧盟境内生产或者进口到欧盟境内大于1 吨·年-1化学物质都需要向欧盟化学品管理署申报登记。美国、日本、韩国等也在修订原有法规，将化学品安全性评估的责任主体转移到企业。我国化学品出口企业必须按照国外法规使用当地国家推荐鱼种进行环境危害评估，这意味着我国企业将付出高昂的成本。因此，推动稀有鮈鲫成为国际公认的模式生物，对于保护本土生态系统，打破国外绿色贸易壁垒具有重要意义。

1.4 斑马鱼成为模式生物的实践历程

稀有鮈鲫和斑马鱼具有几个相同的特征。个体小、养殖花费少，能大规模繁育，胚体透明，发育异常的畸形体很容易鉴定出来。此外，2种鱼的精子均可通过冷冻来保存，给试验操作和遗传学分析提供极为有利的条件。然而这只是模式生物的基本要求。从斑马鱼成为模式生物的实践历程可以发现，它离不开发达国家科学家在20世纪80、90年代作出的突出贡献。20世纪70年代，科研人员开始使用斑马鱼研究水环境污染问题[17]。1981年美国俄勒冈大学的George Streisinger教授在《Nature》上发表了关于如何开展斑马鱼人工雌核发育的文章[18]，为斑马鱼成为模式鱼种开创了道路。20世纪90年代初期，美国俄勒冈大学的Wolfgang Driever、Mark Fishman教授和德国Christiane Nusslein-Volhard领导的团队，在斑马鱼饱和诱变突变体筛选上取得了突破性进展[19-20]，数千尾突变体从德、美2家实验室筛选出来[21]。第一个关于鱼类的斑马鱼基因连锁图也被发表[22]。因此在当年，世界各地从事斑马鱼遗传和发育研究的学者集会美国冷泉港进行了题为“Zebrafish Development and Genetics”的研讨会将斑马鱼的研究推向了一个高潮。不久后，国际两大科学杂志《Science》和《Nature》分别发表评论，认为斑马鱼已完全具备作为脊椎动物发育生物学甚至人类基因组计划模式种的条件，是理想的模式生物。因此，研究斑马鱼成为模式生物的实践历程，对推进稀有鮈鲫作为水生模式生物具有重要参考意义。

2 稀有鮈鲫的生物生态学研究情况(Research situation on biology and ecology of rare minnow)

2.1 稀有鮈鲫生物学特性

稀有鮈鲫属鲤科，鮈鲫属。稀有鮈鲫较广泛地分布于我国四川省的成都平原及其西部边缘地区，涉及岷江中游、沱江上游、大渡河中下游和青衣江中下游。它是我国特有的小型试验鱼种[23-24]。稀有鮈鲫个体全长2～6 cm，一般情况下3个月左右即可产卵；繁殖温度范围在16～28 ℃之间；在控温的条件下能够实现全年的周期性的繁殖[25]。稀有鮈鲫卵的直径约为1.2～1.5 mm，较斑马鱼卵大；卵粒透明度比斑马鱼高，能够清晰地观察到胚胎发育的具体阶段[26]。稀有鮈鲫体型小、生命力强、饲养简便、不易染病、卵膜透明、繁殖季节长，人工控制条件下可周年产卵；性成熟快，产卵批次多，属于连续产卵类型，符合模式动物培养对象的必要条件[27]。图2显示稀有鮈鲫的全生命周期，分为受精卵、胚胎期、卵黄囊阶段、仔鱼、幼鱼和成鱼6个阶段。

2.2 稀有鮈鲫品系

经过多年努力，我国科研人员建立了稀有鮈鲫近交系(HAN)和野生封闭群(IHB)2种品系。稀有鮈鲫近交系(HAN)是将稀有鮈鲫经过长期的配对近交而得，微卫星多态性分析表明近交系(HAN)体内大多数为纯合位点，遗传多样性明显降低，为进行遗传学分析和分子生物学研究提供了基础[28]。野生封闭群是指不从外部引入新个体的条件下，已非近亲交配方式至少繁殖4代以上的实验动物群体。由于封闭群动物遗传组成较接近于自然状态下的群体结构，遗传上具有高度杂合性，遗传特性保持相对稳定，因此十分适合生态毒理研究[29-30]。

2.3 稀有鮈鲫生态毒理学研究

从1990年开始许多学者采用稀有鮈鲫进行生态毒理研究，证明稀有鮈鲫对外源化合物均有很高的敏感性，适合作为我国本土试验鱼种[13,30]。例如，中国科学院水生生物所对稀有鮈鲫的急、慢性毒性测试方法、参比物选择等进行了研究，对比了稀有鮈鲫、剑尾鱼和斑马鱼对金属铬和五氯酚的敏感性，验证了稀有鮈鲫毒性测试方法[8]。中国科学院生态环境研究中心对稀有鮈鲫的内分泌干扰特性做了较为系统的研究[31]，证明对于环境内分泌干扰物，稀有鮈鲫是十分优良的测试鱼种。西南大学、同济大学、武汉大学、华中农业大学等多所高校研究了稀有鮈鲫在外源化合物暴露下，对分子基因、生理生化以及个体和种群效应的影响[32-34]。这些研究为稀有鮈鲫列入水生模式鱼种奠定了良好基础。

3 稀有鮈鲫应用领域和应用情况(Application field and application situation of rare minnow)

经过我国几代科研人员的努力，我们已经有了纯熟的稀有鮈鲫人工繁育技术、人工雌核发育技术、品系鉴定技术、染色体操作技术、基因转移技术等，具备了稀有鮈鲫胚胎发育学和细胞遗传学基础[35-38]。然而与模式鱼种斑马鱼、青鳉相比较，稀有鮈鲫还在品系研究、标准制定、基因研究以及数据与资源保存等应用领域存在差距。

3.1 品系研究领域

稀有鮈鲫的品系主要有近交系(HAN)和野生封闭系(IHB)。目前近交系(30多代)已达到较高的近交程度，与野生种群相比遗传多样性明显降低，为进行遗传学分析和分子生物学研究提供了基础[28]。野生封闭系则十分适合生态毒理研究[30]。但与模式鱼种相比，稀有鮈鲫品系种类较少，突变和转基因还未建立相关品系，制约了其对环境毒理的深入研究。例如，斑马鱼已建立约20个野生品系。其中常用的斑马鱼品系有AB品系、Tuebingen(Tu)品系、WIK品系。斑马鱼还保存有3 000多个突变品系和100多个转基因品系(http://zebrafish.org)。这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。青鱂也建立了10余个野生品系和近交系以及80多个突变系(http://mbase.nig.ac.jp)，同样具备模式种的条件。

图2 稀有鮈鲫全生命周期Fig. 2 Life circle of rare minnow

有鉴于此，有必要加强稀有鮈鲫品系培育和筛选，特别是大力构建稀有鮈鲫转基因品系和突变品系，为拓展稀有鮈鲫研究应用领域奠定坚实基础。

3.2 标准制定领域

斑马鱼和青鳉是目前国外测试标准或指南中的主要推荐鱼种。例如，斑马鱼和青鱂是国际标准化组织(ISO)推荐的毒性试验材料鱼(ISO 7346-1996)[39]，还是OECD鱼类毒性试验的推荐用鱼(OECD TG 203)[40]。由于这2种鱼具有繁殖快、饲养管理方便、取材容易等特点，是鱼类毒性试验较理想的对象。稀有鮈鲫同样具备上述特性。目前我国正陆续研究制定使用稀有鮈鲫的相关测试标准与规范。例如，已制定发布了化学品稀有鮈鲫急性毒性试验(GB/T 29763—2013)、化学品鱼类急性毒性试验(GB/T 27861—2011)、化学品鱼类胚胎和卵黄囊阶段短期毒性试验(GB/T 27807—2008)、化学品鱼类幼体生长试验(GB/T 27806—2008)、化学品鱼类早期生活阶段毒性(GB/T 21854—2008)等标准和规范均推荐使用稀有鮈鲫作为测试鱼种[41-45]。此外，还有多个关于稀有鮈鲫的毒性试验标准正在制定中。2004年我国环境保护部将稀有鮈鲫作为推荐测试鱼种，为我国新化学物质登记提供了大量基础数据[46-47]。然而随着化学品环境研究的不断深入，基于全生命周期的胚胎毒性、繁殖毒性、发育毒性及内分泌干扰效应等慢性生物毒性测试方法发展迅速，化学品环境危害性的内涵在不断丰富与发展。以稀有鮈鲫急性毒性测试为主的化学品生态毒理测试技术已不能满足发展的要求。

因此，亟需制定稀有鮈鲫质量标准、饲养管理标准，建立稀有鮈鲫基于发育毒性、胚胎毒性、繁殖毒性和内分泌干扰效应的测试标准，以满足化学品测试技术的发展要求。

3.3 基因研究领域

稀有鮈鲫在基因研究方面与斑马鱼和青鳉还存在较大差距。虽然稀有鮈鲫的基因研究也在不断深入[36-37,48]，但总体还处在起步阶段，难以形成体系。而斑马鱼和青鳉已完成了基因组测序，并在此基础上建立了较为完整的基因表达、基因功能的研究方法[49-50]。随着基因编辑技术的发展，还可以方便快捷地建立各类突变品系和转基因品系用于各种研究目的[51-52]。例如，转基因斑马鱼含有特定污染物的效应元件结合的报告基因，当水体中含有特定环境污染物时，基因被激活并与报告基因共同表达，使鱼体呈现荧光，并可根据荧光的强度来表征特定污染物的浓度。斑马鱼中关键的性别分化基因分别是负责雌性分化的基因(fig-а, cyp1a9)和负责雄性分化的基因(ar, sox9a, dmrt1)[53-55]。青鳉的性别决定基因也已被探明，雄鱼Y染色体上Dmy是启动精巢发育的决定基因，已被用于性分化测试中的性别鉴定[56]。

因此，亟待加强稀有鮈鲫分子生物学的深入研究。开展稀有鮈鲫基因组测序，建立稀有鮈鲫基因表达、基因功能的研究方法，特别是加强关键基因组功能(如性别鉴定基因、生长发育基因)的研究。

3.4 数据和资源保存领域

稀有鮈鲫目前还没有建立数据和资源保存中心，相关的数据分散在各种专业文献和数据库中。而斑马鱼目前是模式生物数据与资源保存的典范。国际斑马鱼资源中心(ZIRC，美国)负责已有斑马鱼品系和相关研究资源收集、保藏和分享。国际斑马鱼基因数据库ZFIN(http://zfin/org)里收集了所有关于斑马鱼的基因组测序以及功能基因的相关数据可供查询、下载和研究。主要包括基因图谱信息、斑马鱼所有已知基因、分子标记、各种克隆等。青鳉也建立了网络数据资源，保存了大量突变系和基因组测序等一系列分子生物学资料，Medaka Genome Database (http://mbase.nig.ac.jp)(青鳉数据库，日本)供研究者下载。

鉴于稀有鮈鲫在此领域存在的巨大差距，我国亟需建立稀有鮈鲫数据库，搜集稀有鮈鲫相关文献、基因信息、品系信息、形态解剖信息等。收集研究者提交的新品系、基因、克隆等信息。为研究者提供上述各类信息的检索服务，从而推进对稀有鮈鲫的深入研究。

表1 稀有鮈鲫和模式鱼种斑马鱼、青鱂的比较Table 1 Comparison of Gobiocypris rarus, Danio rerio and Oryzias latipes

4 结语(Conclusion)

稀有鮈鲫是一种优良的试验用鱼，被我国环境保护部列为新化学物质测试推荐鱼种。本文对稀有鮈鲫成为水生模式生物进行了研究探讨，表明稀有鮈鲫具备成为水生模式生物的必要条件。虽然与模式生物斑马鱼、青鳉对比，稀有鮈鲫仍存在不足和差距，但文中对此提出了针对性的建议。目前，我国关于稀有鮈鲫的研究正在不断深入，职能管理部门及科研人员对其的关注和重视程度也在不断提高。故而稀有鮈鲫作为本土物种一旦成为国际公认的模式生物将具有极其重要的意义。

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