HIV—1型Nef基因重组表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立

李苗苗+杨霄旭+杨朝霞+向双林+韩梅

摘要为了构建艾滋病毒HIV1型Nef基因重组表达载体，利用PCR从pNL43质粒上扩增 HIV1型Nef基因，获得Nef基因完整的编码区，构建可表达Nef蛋白的 pEBmycnef重组表达载体.经鉴定正确后，利用 LipofectamineTM 2000将重组质粒转染SW480细胞，通过Western Blot技术检测 Nef蛋白的瞬时表达.为了建立稳定表达Nef基因的SW480細胞系，采用G418筛选建立稳定表达细胞系的方法，筛选出单克隆细胞系.扩大培养克隆细胞后，通过RTPCR和Western Blot分别检测Nef的mRNA转录水平及蛋白表达水平，经长达60 d的传代，最终获得稳定表达Nef基因的SW480细胞系，为研究RNAi在艾滋病治疗方面的应用提供了细胞模型.

关键词Nef基因；SW480细胞；G418；稳定细胞系

艾滋病（AIDS）全称为“获得性免疫缺陷综合征”，是一种由人免疫缺陷病毒（HIV）引起的，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病.RNA干扰（RNAi）是细胞内序列特异性抑制靶基因表达的机制，具有高效性、特异性和副作用小的特点，将其应用于抗HIV1 治疗研究是近来研究热点[12].RNAi抑制HIV1的复制，最直接的方法就是利用RNAi方法直接干扰HIV1病毒的RNA，据文献报道几乎HIVl的所有基因都可作为干扰的靶点：如LTR[3]〖KG-*6〗，gag[45]〖KG-*6〗，pol[6]〖KG-*6〗，vpu[7]〖KG-*6〗，vif[5]〖KG-*6〗，tat[8]和env[9]等基因.RNAi还可以将干扰的位点靶定到细胞上与HIV病毒感染密切相关的受体蛋白、辅助受体蛋白或其他的一些细胞因子[10].

负调控因子（negative factor，Nef） 是人免疫缺陷病毒（ HIV） 附属蛋白之一，相对分子质量小，柔韧性大，核心结构呈球形.Nef 不具酶活性，具有衔接蛋白的作用，可下调 CD4，主要组织相容性复合体Ⅰ（MHCⅠ），主要组织相容性复合体Ⅱ（MHC Ⅱ）和 CD28 分子，在对抗宿主免疫应答过程中发挥重要作用.Nef 可增强病毒的复制和感染性，抑制 HIV 感染细胞的凋亡，在 HIV 致病机制方面也发挥关键作用.基于Nef在体内的致病机制，多种抗HIV1病毒策略被提出，使Nef成为潜在的HIV1靶点.本文试图构建稳定表达HIV1型Nef蛋白的SW480细胞系，为研究RNAi在艾滋病治疗方面的应用提供细胞模型.

1材料和方法

1.1材料

大肠杆菌TOP10感受态细菌、pEBMultineomyc质粒、pNL43质粒、SW480细胞（人结肠癌细胞）均由本实验室保存；RNA提取试剂TRIzol和LipofectamineTM2000转染试剂购自Invitrogen公司； Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ与NotⅠ购自ThermoFisher公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒和去内毒试剂购自广州东盛生物科技有限公司；G418购自Sigma公司；小鼠源Antimyc抗体、内参蛋白actin抗体和HRP标记羊抗小鼠IgG均购自Santa Cruz公司；细胞培养所用的DMEM培养基和胎牛血清购自美国HyClone公司；其他常规试剂与耗材均购自于上海生工生物科技有限公司.

1.2引物设计合成

参照pNL43质粒上HIV1型Nef基因序列，利用Primer Premier 5 以及Nebcutter 2.0软件设计的引物如下：Nef正向引物，5′CGCGGATCCGGGTGGCAAGTGGGTC3′；Nef反向引物，5′ATTTGCGGCCGCTCAGCAGCTCTTGAAGTAC 3′.分别在上游引物和下游引物5′端加上了BamHⅠ和NotⅠ酶切位点和相应的保护碱基，引物由上海生工生物有限公司合成.

1.3HIV1型Nef片段的扩增

以pNL43质粒为模板，使用Ex Taq DNA聚合酶，采用PCR扩增全长HIV1型Nef基因编码区，全长640 bp.PCR扩增体系（20 μL）：10× Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.5 g/L pNL43质粒 1 μL，正向引物和反向引物（10 nmol/L）各1 μL，Ex Taq DNA聚合酶 0.25 μL，ddH2O 14.5 μL.PCR 的扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共进行32个循环，72 ℃继续延伸10 min.得到的PCR产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，根据片段大小用DNA纯化试剂盒进行切胶回收.

1.4HIV1型Nef真核表达载体构建

将上述PCR产物和pEBMultineomyc质粒分别用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ双酶切后， 1%琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收纯化，经T4 DNA连接酶过夜连接后转化E.coli TOP10感受态，卡那霉素LB固体培养基筛选培养，挑取阳性克隆扩增后，进行菌液PCR鉴定，提取质粒进行酶切和DNA测序鉴定.

1.5重组表达载体的瞬时表达及Western Blot检测

SW480细胞培养于添加10%胎牛血清和100×青霉素链霉素双抗混合液的DMEM培养液中，在转染前，将细胞接种于6 cm培养皿，接种量为2×106个细胞，过夜培养使其密度达80%～90%.参照LipofectamineTM2000转染试剂产品说明书，将8 μg pEBmycnef重组表达质粒转染SW480细胞，以转染空载体pEBMultineomyc质粒的SW480细胞为对照，48 h后收集细胞.冰上收获细胞，经裂解后离心取上清，加入上样缓冲液和DTT煮沸10 min.用10%SDSPAGE胶分离细胞蛋白，上样20 μg.110 V恒压80 min转至PVDF膜上.将转膜后的PVDF膜用含5%的脱脂奶粉过夜封闭.再孵育小鼠抗myc的抗体，充分洗膜，随后孵育HRP标记羊抗小鼠IgG，充分洗膜.然后各取1 mL ECL化学发光试剂A和B液混匀，5 min后平铺于膜的蛋白面，〖HJ2.1mm〗通过显影仪（Tonon公司）显影拍照.

1.6SW480细胞G418最低致死浓度的测定

将SW480细胞接种于96孔培养板中，在CO2培养箱中37 ℃培养.待细胞密度达到80%后，使用不同浓度G418（0，100， 200，300，400，500，600，700，800，900，1000 mg/L）的DMEM完全培养基培养细胞，每天更换培养基，连续观察12 d，确定全部细胞死亡的最低浓度，即为最佳的G418篩选浓度.

1.7稳定表达Nef基因的SW480细胞株的筛选和鉴定

SW480细胞接种于24孔板，培养16 h，细胞贴壁生长至汇合度达80%时，将0.8 μg pEBmycnef质粒在20μL脂质体Lipofectamine 2000TM介导下转染SW480细胞.48 h后将细胞1∶10稀释转种24孔板，同时加入终浓度为900 mg/L的G418，同时设pEBMultineomyc质粒转染对照.2～3 d换液1次，待大部分细胞死亡之后，改用450 mg/L G418的培养液维持压力筛选3周，挑出单个细胞集落，有限稀释到96孔板进行单克隆筛选，筛选出的单克隆细胞依次于48孔、12孔、6孔板及6 cm和10 cm培养皿扩大培养.扩大培养到一定量后，进行冷冻保存.剩余的一些细胞连续传代60 d以上（约30代），取一部分细胞进行Nef的RTPCR检测和Western Blot检测，确保细胞株的稳定性.

2结果

2.1HIV1 Nef基因PCR扩增结果

使用PCR方法扩增Nef基因产物，将20 μL PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后，可见1条约640 bp大小的片段（如图1），片段大小符合预期，说明已成功扩增出HIV1 Nef基因.

2.2真核表达载体pEBmycNef的鉴定

2.2.1转化菌中Nef基因的PCR鉴定将上述过夜连接的产物转化E.coli Top10感受态细胞，卡那霉素LB固体培养基筛选培养，挑取4个克隆扩增后，进行菌夜PCR鉴定，结果如图2所示，琼脂糖电泳可见一条约为640 bp大小的Nef目的基因条带，与预期的条带大小吻合.

2.2.2重组表达质粒pEBmycNef的双酶切鉴定

重组载体pEBmycNef经BamH Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后，琼脂糖电泳可见一条约为640 bp大小的Nef目的基因条带，一条为10 223 bp大小的pEBMultineomyc条带（图3），说明载体构建正确.

PCR扩增的Nef全长DNA序列插入pEBMultineomyc载体，测序结果与pNL43质粒报道的Nef序列相符，表明Nef全长编码区DNA成功插入到pEBMultineomyc质粒中，且插入方向和阅读框架均正确.

2.3SW480细胞G418最低致死浓度的测定

使用G418终浓度分别为0～1 000 mg/L的DMEM培养液培养SW480细胞，观察细胞的死亡情况. 实验发现，加药后1 d，细胞形态正常，未出现明显的变化；持续筛选7 d，大量细胞开始脱落死亡，贴于培养皿底部的细胞逐渐变圆；至12 d，细胞全部死亡（图4）.确定SW480细胞全部死亡的最低浓度为900 mg/L.

2.4Nef基因在SW480细胞中的瞬时表达

将重组质粒pEBmycNef和载体质粒pEBMultineomyc分别转染SW480细胞，收集细胞，裂解后上样进行Western Blot检测，结果如图5所示.重组质粒pEBmycNef转染细胞中在约29 000处有特异性条带，而载体质粒pEBMultineomyc转染细胞中没有，表明HIVl Nef基因在SW480细胞中进行了表达.图中actin蛋白为内参蛋白.

2.5稳定表达Nef基因的SW480细胞系的鉴定

pEBmycNef质粒转染SW480细胞后，经G418抗性筛选3周后，在显微镜下挑选出了4个细胞集落，经传代扩增后，用Western Blot技术检测到Nef的表达，而空载对照SW480细胞则未检测到Nef基因的表达（图6），并且在连续传代60 d后，通过RTPCR技术和Western Blot技术，仍可以检测到 Nef基因的转录（图7）与表达（图8）.以上结果表明，已筛选到稳定表达HIV1型Nef基因的SW480细胞株.

3讨论

RNAi通过降解mRNA或抑制蛋白质来沉默基因这种技术在生物学研究领域具有极重要的意义，RNAi不仅可以作为基因功能研究与评价的方法工具，它还可以作为一种基因治疗的手段.2001年Tusehl研究组开创了RNAi技术治疗人类疾病的新途径.将RNAi用于病毒性疾病的治疗和预防研究取得了一些显著的效果，比如乙肝病毒（HBV）[13]、丙肝病毒（HCV）[14]、人乳头瘤病毒（HPV）[15]、EB病毒[16].将RNAi应用于艾滋病治疗的文献也不计其数[17]，这些研究都为HIV1的基因治疗提供了很好的参考依据.但是RNAi还无法应用于临床治疗艾滋病，阻碍这一进程的是RNAi的传递模式.

2006年，向双林等提出利用修改过的非治病性细菌在体内及体外定向传递shRNA到靶细胞中以发挥干扰作用.他们将这种依赖细菌进行的RNAi传递技术称之为TransKingdom RNAi （tkRNAi）[18].该研究的最终目的是将这种依赖细菌进行的RNAi传递技术应用到干扰艾滋病病毒的基因研究中，试图探寻更有效的RNAi传递方法，为将RNAi应用到临床上治疗艾滋病提供理论依据.由于HIV病毒基因的RNAi干扰实验在体内无法进行，构建能够稳定表达HIV1型病毒蛋白的细胞模型显得至关重要.

本实验从pNL43质粒上扩增出Nef基因，随后与pEBMultineomyc质粒共同经BamHⅠ和NotⅠ双酶切，连接并转化构建成pEBmycnef真核表达质粒.通过菌液PCR验证、双酶切验证和DNA测序分析证明nef全长编码区DNA成功插入到pEBMultineomyc质粒中，且插入方向和阅读框架均正确.利用 LipofectamineTM 2000将重组质粒转染SW480细胞，培养48 h后，裂解细胞，收集蛋白，利用Western Blot技术检测到 Nef蛋白的瞬时表达.然后利用G418筛选建立稳定表达细胞系的方法，首次建立了稳定表达HIV1型Nef基因的SW480细胞系，为研究tkRNAi在艾滋病治疗方面的应用提供了细胞模型.

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