山柰素对照品的制备研究

侯红瑞，陈 玲, 王春晓, 孙国勇, 张小凤

（1. 茂名职业技术学院， 广东 茂名 525000； 2. 华南理工大学 食品科学与工程学院， 广东 广州 510640）

山柰素对照品的制备研究

侯红瑞1，陈 玲2, 王春晓1, 孙国勇1, 张小凤1

（1. 茂名职业技术学院， 广东 茂名 525000； 2. 华南理工大学 食品科学与工程学院， 广东 广州 510640）

建立从高良姜中制备山柰素对照品的方法，结合吸附树脂和制备型高效液相色谱对高良姜乙醇提取物进行分离纯化，通过 IR、MS 和 NMR 进行结构鉴定，分析型 HPLC 面积归一化法进行纯度检查和含量测定，得山柰素对照品纯度符合国家药典要求，质量分数大于 99.8%，建立的制备方法简单，对照品纯度高，可作为山柰素药效物质基础研究的标准对照品。

山柰素；高良姜；对照品；制备方法

高良姜(Alpinia officinarum Hance)为姜科多年生草本植物的干燥根茎，主要分布于福建、广东、广西、海南等省。具有温胃、祛风、散寒、行气、止痛的功效，常用于脘腹冷痛，胃寒呕吐，嗳气吞酸等症状的治疗，收载于《中国药典》2015 年版［1-3］。山柰素为高良姜中黄酮类化合物之一，具有抗癌[4]、抗菌、抗炎及减少皮肤细胞黑素合成[5]等药理活性，可作为一个能反映高良姜部分功效的指标成分进行分析。由于高良姜中黄酮类化合物性质相近，导致山柰素单体的分离难度较大，且文献检索尚无对山柰素对照品的制备，这给山柰素的药理活性研究造成极大不方便。本文在系统研究了大孔吸附树脂分离纯化高良姜总黄酮工艺的基础上，采取制备型高效液相色谱（preparative highperformance liquid chromatography，PHPLC）制备山柰素对照品。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

高良姜药材，市售; HPD-600 树脂（河北沧州宝恩化工有限公司）;95%乙醇、无水乙醇均为分析纯;二甲基亚砜、甲醇、乙腈均为色谱纯;山奈素标准品（上海友思生物技术有限公司，批号 150212）。

法国 Gilson GX-281制备/分析型高效液相色谱仪，Gilson 156 UV/VIS 检测器，六通进样阀，TRILUTION®LC 色谱工作站，Tensor37 红外光谱仪，Esquire HCTpLUS 质谱仪，UV-2102pC 型紫外可见分光光度计，BT00-100M 恒流泵，BSZ-100 自动收集器。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮供试液制备工艺

称取 1kg 干燥的高良姜药材，粉碎至 10～20目，加 80%乙醇 500 mL 溶解超声提取，提取液旋转蒸发浓缩，真空烘干，加 50%乙醇稀释到 0.9 mg/mL 即得黄酮供试液，冷藏备用。

1.2.2 高良姜总黄酮纯度及得率计算

式中：X ——洗脱液中黄酮浓度；

V ——洗脱液体积；

G ——洗脱液浓缩烘干后得固形物重量。

式中：X ，X样——分别为洗脱液和上样液中黄酮浓度；

V， V样——分别为洗脱液体积和上样液体积。

1.3 色谱条件

1.3.1 分析型 HPLC

色谱柱：Venusil XBP-C18 液相色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5.0 µm）；流速：1.0 mL/min；检测波长：367 nm；进样量：20 µL；柱温：常温；流动相：甲醇- 0.5%(v/v)磷酸水溶液（58:42，v/v）。

1.3.2 制备型 HPLC

色谱柱：Venusil XBP-C18 液相色谱柱（250 mm ×21mm，5.0 μm）；流速：5.0 mL/min；检测波长：367 nm；柱温：常温；流动相：甲醇- 0.5% (v/v)磷酸水溶液（58:42，v/v）[6]。

2 结果与讨论

2.1大孔吸附树脂纯化高良姜黄酮类化合物的工艺

2.1.1 动态泄露曲线的绘制

称取 100 g HPD-600 大孔吸附树脂，95%乙醇浸泡 24 h 预处理，湿法装柱[7]（直径×高度： 400 mm ×26 mm，柱体积：200 mL），以 1.7 BV/h 上样流速将浓度为 0.9 mg/mL 的高良姜黄酮粗提液进柱，收集流出液，每 200 mL（1BV）为一份，紫外分光光度法在 367 nm 处测定流出液吸光度 A，采用标准曲线法计算流出液中高良姜总黄酮的浓度，绘制树脂的泄漏曲线，考察树脂动态吸附性能，确定泄漏点(图 1)。

图1 高良姜黄酮类化合物动态吸附泄漏曲线Fig.1Leak curve of dynamic adsorption

由图1可见，高良姜黄酮类化合物流出液浓度变化呈 S 形曲线，在曲线的下拐点 12 BV 之前，流出液中高良姜总黄酮含量浓度小于 0.05 mg/mL 且基本保持不变。12 BV 之后，随着高良姜黄酮类化合物流出液体积不断增大，流出液的浓度也不断增加，到达上拐点 23 BV 时，收集流出液中高良姜总黄酮含量浓度为 0.36 mg/mL，此时，树脂吸附趋于饱和。通常将下拐点称为泄漏点，上拐点称为饱和点（吸附液流出浓度达到上样浓度的95%的点确定为饱和点）。在实际生产中，为确保生产效益，吸附柱有效工作区一般控制在泄漏点之前，因此，本实验确定流出液浓度达到 0.05 mg/mL 时为吸附泄漏点。

2.1.2 洗脱流速的选择

将高良姜供试液 0.9 mg/mL，体积为 3 000 mL以上样流速为 1.7 BV/h 进行动态吸附，待吸附达到泄漏点，静置 5 min 后用蒸馏水洗脱 30 min，除去蛋白质、多糖等杂质。对吸附达到泄漏点的吸附柱用 85%的乙醇水溶液进行洗脱[8]，洗脱流速分别为1.5 BV/h，1.0 BV/h，0.5 BV/h，洗脱液每 20 mL 收集一份，利用紫外分光光度法在 367 nm 处测定收集液吸光度 A，并计算解析率(图 2)。

图2 不同洗脱流速动态洗脱曲线Fig.2 Dynamic elution curve of different eluted flow rate

洗脱流速一般都要求较慢，这是因为流速过快，洗脱性能差，洗脱带宽，且拖尾现象严重，造成洗脱不完全，但流速过慢，会使周期延长。常用的洗脱流速是吸附流速的 1/3～1/2，故本实验用 85%乙醇溶液，洗脱流速分别为 1.5 BV/h，1.0 BV/h，0.5 BV/h 来考察洗脱流速对洗脱效果的影响，结果如图2 所示。从图 2 可以看出，以 0.5 BV/h 的洗脱流速进行洗脱得到的洗脱峰峰形最窄，且峰高最高，而1.0 BV/h 和 1.5B V/h 洗脱流速进行洗脱的洗脱峰峰高较低，有拖尾现象且拖尾峰出现较早，因此选择洗脱流速以 0.5 BV/h 为宜。

采用上述优化后的工艺参数对高良姜黄酮粗提物进行大孔吸附树脂分离纯化验证实验，即HPD-600 型大孔吸附树脂在上样浓度为 0.9 mg/mL，上样流速为 1.7 BV/h，洗脱剂乙醇浓度为 85%，洗脱流速为 0.5 BV/h 的工艺参数下分离纯化高良姜黄酮类化合物，纯化后获得高良姜黄酮纯化品，纯度为 93.56%，得率为 52.70%。

2.2 对照品的制备

取经大孔吸附树脂纯化的高良姜黄酮溶于甲醇溶液配制浓度为 20.0 mg/mL，用制备高效液相色谱法分离，进样量为 600 µL，采用自动馏分收集器收集，收集保留时间为 40 min 后的流出液，每 1min收集一管，合并收集液，旋转蒸发进行浓缩，将浓缩液冷冻干燥得黄色针状结晶，185 mg(图 3)。

图3 山柰素对照品的制备 HPLC 图谱Fig. 3preparative HPLC chromatogram of Kaempferide reference substance

2.3 对照品纯度检测

对照品经分析型高效液相色谱检测，归一化法定量，其质量分数大于 99.8%，见图 4。

图4 山柰素对照品的 HPLC 图谱Fig.4 HPLC chromatogram of Kaempferide reference substance

2.4 结构鉴定

2.4.1 红外光谱分析

将山柰素标准品和山奈素对照品分别在 50℃真空干燥箱干燥 12 h 后，采用 KBr压片法，按 1%的比例与KBr充分混合、研磨、压片后置于红外光谱仪上测试。扫描波数范围为 4 000～400 cm-1，分辨率为 4 cm-1，采用 DTGS 检测器，以空气为空白，扫描 64 次后区平均值得到山奈素标准品和山柰素对照品的红外光谱图，如图5所示。

从图5可以看到，山柰素对照品和山奈素标准品的红外光谱特征吸收峰相同，3 288 cm-1为-OH特征峰；1665 cm-1为 C=O 特征吸收峰，1602 cm-1，1560，1511，1439 cm-1是芳环的骨架伸缩振动特征峰；1171cm-1为芳香醚特征吸收峰。

图5 山柰素对照品和山柰素标准品的红外光谱图Fig.5 FTIR spectrum of Kaempferide reference substance and Kaempferide

2.4.2 质谱和核磁共振分析

制备得山柰素对照品分别溶解于甲醇和氘代DMSO 中做质谱分析（ESI-MS）和核磁共振分析，经 ESI-MS 检测鉴定，得山柰素对照品相对分子质量为 299.3，见图 6 所示。

图6 山柰素对照品的一级质谱图Fig.6 ESI-MS spectrum of Kaempferide reference substance

氢谱和碳谱核磁数据归属如下：1H-NMR(DMSO-d6)：3.8(3H，s，-OCH3)，6.2（1H，d，J=2.0Hz，H-6）6.4(1H，d，J=2.0Hz，H-8)，7.1(2H，d，J=9.5Hz，H-3′，5′)，8.1(2H，d，J=9Hz，H-2′，6′)，9.5（1H，s，OH-3），10.8（OH-7），12.4（1H，s，OH-5）。13C-NMR（DMSO-d6）：146.7（C-2），136.5（C-3），176.5（C-4），156.7（C-5），98.7（C-6），164.5（C-7），94.0（C-8），161.2（C-9），103.6（C-10），123.7（C-1′），129.8（C-2′），114.5（C-3′），160.9（C-4′），114.5（C-5′），129.8（C-6′），55.8（-OCH3）。

以上光谱数据与山柰素谱图数据基本一致[9,10]，所得化合物为山柰素。

3 结 论

本文确立了利用大孔吸附树脂和制备型高效液相色谱相结合从高良姜中制备山柰素对照品的方法，具有分离条件简单，操作高效、快速等优点，且树脂可重复使用，降低生产成本。制备出的山柰素对照品纯度高，该方法为制备山柰素对照品提供了一条可行的思路。

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Study onpreparation of Kaempferide Reference Substance From Alpinia officinarum Hance

HOU Hong-rui1, CHEN Ling2, WANG Chun-xiao1, SUN Guo-yong1, ZHANG Xiao-feng1
（1. Maomingpolytechnic, Guangdong Maoming 525000，China；2. School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangdong Guangzhou 510640，China）

Apreparation method of kaempferide reference substance from Alpinia officinarum Hance was established; the extract from Alpinia officinarum Hance was isolated andpurified by adsorption resin andpreparative HPLC. The structure of kaempferide reference substance was identified by IR, MS and NMR. Thepurity of theproduct was quantitated by analytical HPLC area normalization method, the mass fraction was above 99.8%. This method is effective forpreparation of kaempferide with highpurity. It can be used toprepare the reference substances for the quantitative analysis of Chinese materia medica.

Kaempferide; Alpinia- officinarum Hance; Reference substance;preparation

TQ 000

： A

： 1671-0460（2017）02-0243-03

茂名市科技计划项目，项目号：[2015]14 号。

2016-10-12

侯红瑞（1984-），女，宁夏固原市人，讲师，硕士，2008 年毕业于华南理工大学制糖工程专业，研究方向：天然产物的研究与开发。E-mail：sherysky@163.com。