改进MSPD-HPLC法快速检测猪血豆腐中镇静剂及雌激素残留

罗慧玉，徐鹏，*，闫伟伟，陈建华

（1.张家口市食品药品检验中心，河北张家口075000；2.宣化钢铁公司职工医院，河北张家口075100）

改进MSPD-HPLC法快速检测猪血豆腐中镇静剂及雌激素残留

罗慧玉1，徐鹏1，*，闫伟伟1，陈建华2

（1.张家口市食品药品检验中心，河北张家口075000；2.宣化钢铁公司职工医院，河北张家口075100）

建立改进了的基质固相分散萃取（MSPD）-高效液相色谱法（HPLC/UVD）同时快速检测猪血豆腐中的4种镇静剂（艾司唑仑、阿普唑仑、氯氮和地西泮）及己烯雌酚残留的方法。样品以无水硫酸钠和弗洛里西土（质量比4∶1）为分散剂和净化剂，甲醇为溶剂。色谱条件：C18色谱柱（5μm，250mm×4.6mm i.d.），甲醇-乙腈-水（体积比30∶30∶40）为流动相，流速：1.0mL/min，检测波长235 nm，柱温：30℃。5组分在0.010μg/mL～10μg/mL范围内线性关系良好，相关系数均不低于0.999 2。猪血豆腐中4种镇静剂的方法检出限均为10 ng/g，己烯雌酚的方法检出限为15 ng/g；5组分平均回收率在82.4%～104.5%之间，相对标准偏差为1.7%～3.5%。结果表明该方法简便、快速、经济，适用于猪血豆腐中己烯雌酚及多种镇静剂类药物残留的快速检测。

基质固相分散萃取；高效液相色谱法；猪血豆腐；镇静剂；雌激素

镇静剂类药物（Sedatives）对中枢神经系统有一定的抑制作用，可以减轻或消除动物狂躁不安，该类药物除具有镇静作为外，很多还是生长促进剂，具有使动物嗜睡少动，生长快速、改变肉质的作用。另外，在动物运输过程中使用该类药物，可减少动物体重下降和死亡，还可防止动物肉的品质降低。近年来，一些不法商贩在动物饲养和运输过程中擅自非法添加使用这些药物，使其原形和代谢产物不可避免的残留于动物源食品中，造成食品安全隐患，进而对人体健康造成不良影响。己烯雌酚是一种人工合成非甾体类雌激素，能够促进家畜的生长，长期食用含己烯雌酚的食品易致儿童性早熟、男性生殖系统异常，女性易发生乳腺癌等[1]。我国农业部第176号公告规定严禁在动物饲料和饮用水中使用这两类药物，在动物源食品中不得检出。

目前，检测镇静剂类药物的方法有：液相色谱法（HPLC）[2]，高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/ MS）[3-4]，气相色谱/质谱法（GC/MS）[5]等。检测雌激素类药物的方法有：高效液相色谱法测定（HPLC）[6]，气相色谱法[7]，高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[8]，酶联免疫检测法[9]等。HPLC-MS/MS和GC-MS方法具有准确性好、灵敏度高等优点，但仪器价格昂贵，普及范围受到限制。

基质固相分散萃取（MSPD）是由Barker等[10]首次提出的一种样品处理技术。MSPD法是将常规的固相分散技术与反向键合填料相结合，使得组织匀浆、提取和净化能够在同一操作中完成。我们对该方法做了进一步的优化和改进，省略了溶解、装填柱子、洗脱等步骤，处理步骤大为减少、方法操作更为简化，结合高效液相色谱，对猪血豆腐中4种镇静剂艾司唑仑、阿普唑仑、地西泮、氯氮及雌激素己烯雌酚进行了快速分析测定。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

LC 2010A HT高效液相色谱仪、LC-2010HT紫外检测器、SPD-M10A VP二极管阵列检测器：岛津公司；LC-Solution色谱工作站；YF-103型粉碎机：瑞安市永历制药机械有限公司；XH-D涡旋混合器：江苏天翎仪器有限公司；800型电动离心机：江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；KL512J型水浴氮吹仪：北京康林科技有限责任公司；Milli-Q Integral纯水/超纯水机：美国Millipore公司。

艾司唑仑（批号：1219-0102）、阿普唑仑（批号：171218-200603）、氯氮（批号：171248-200301）、地西泮（批号：171225-200302）、己烯雌酚（批号：100033-200607，含量：99.9%）：购自中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈为色谱纯；所用水为超纯水；其余试剂均为分析纯；猪血豆腐：购自超市。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的制备

1.2.2 色谱条件

色谱柱：YMCC18柱（5μm，250mm×4.6mm i.d.）；柱温：30℃；流动相∶甲醇-乙腈-水（30∶30∶40）；流速：1.0mL/min；检测波长：235 nm；进样量：10μL。

1.2.3 样品处理

称取匀浆好的猪血豆腐样品1.0 g于研钵中，加入4.0 g混合分散剂[无水硫酸钠∶弗洛里西土（质量比4∶1）]，充分研磨至表面无残余水分；将研磨好的样品转移至具塞三角瓶中，加入10mL甲醇，涡旋震荡1min，离心，取上清液；残渣移入上述具塞三角瓶中，再用6mL甲醇分两次加入到三角瓶中同法进行萃取（每次3mL）；将3次萃取所得上清液合并后用氮吹浓缩至5.0mL，经0.22μm滤膜过滤后取10μL进样分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

本试验采用甲醇-乙腈-水作为流动相，考察了不同体积比对各组分的保留时间和分离情况，结果表明甲醇-乙腈-水体积比为30∶30∶40时，艾司唑仑、阿普唑仑、氯氮、己烯雌酚、地西泮5组分能完全分开，峰型较好，保留时间相对较短。因此本试验采用体积比为30∶30∶40的甲醇-乙腈-水体系作为流动相。标准物谱图见图1。

图1 标准溶液色谱图Fig.1 Chromatograms of standard solution

2.2 分散剂种类及用量的选择

在基质固相分散样品处理方法中，分散剂多为各类吸附剂，如硅胶、氧化铝、弗洛里西土等，试验考察了不同的分散剂。当分散剂全部为弗洛里西土时，样品水分残留过多，我们提出向分散剂中加入无水硫酸钠，无水硫酸钠能够很好地吸收样品中的水分，同时破坏样品组织。试验考察了不同比例的无水硫酸钠与弗洛里西土混合分散剂对试验效果的影响，当无水硫酸钠与弗洛里西土（质量比4∶1）作为分散剂时，既能很好的吸附样品中的水分，同时又能对样品有一定的净化作用。试验考察了混合分散剂用量为1.0 g～6.0 g时对试验效果的影响。经比较当样品与混合分散剂为1∶3以下时，基质干扰严重，当所加混合分散剂为4.0 g时，猪血豆腐中的水分被完全吸收、分散效果良好且样品得到很好的净化。如图2所示。

图2 样品与分散剂比例对萃取效果的影响Fig.2 The influence of the samples and dispersant quality ratio over the extraction effect

2.3 萃取剂用量的选择

5种待测物在甲醇中溶解性良好，且只作为极性溶剂的甲醇不易把样品中的非极性干扰物萃取出来，故选用甲醇作萃取剂。萃取剂体积对萃取效果的影响如图3所示。

图3 萃取剂体积对萃取效果的影响Fig.3 The influence of extractant volume over the extraction effect

考察了不同萃取剂体积对试验效果的影响，样品为1.0 g时，萃取体积在10mL～18mL，随着溶剂体积加大，各组分峰面积值增大，当萃取体积超过16mL时，各组分峰面积值趋于平缓或下降，故选择16mL为最佳萃取体积。

2.4 萃取次数的选择

在萃取剂体积相同的条件下，萃取次数会直接影响样品回收率。萃取次数对萃取效果的影响如表1所示。

表1 萃取次数对萃取效果的影响Table1 The influence of extractant times over the extraction effect

试验同时考察了萃取剂总体积为16mL时，不同萃取次数对萃取效果的影响，结果显示当萃取次数为3次时，各组分回收率达到82.4%～104.4%。

2.5 线性方程、检出限和定量限

各成分线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限见表2。

表2 线性方程和检出限Table2 Linearity and detection limits

移取储备液逐级稀释，配成一系列浓度的混合工作溶液，在所选的色谱条件下，以峰面积对质量浓度绘制工作曲线，5种化合物在0.010μg/mL～10μg/mL范围内线性关系良好，相关系数均不低于0.999 2。

在样品测定的色谱条件下，以3倍信噪比确定各成分的最低检出限：艾司唑仑、阿普唑仑、氯氮、地西泮为0.01μg/g，己烯雌酚为0.015μg/g；以10倍信噪比确定各成分的定量限：艾司唑仑、阿普唑仑、氯氮、地西泮为0.033μg/g，己烯雌酚为0.05μg/g。

2.6 加标回收率和精密度

取1.0 g市售猪血豆腐6份，按1μg/g的加标水平，加入一定量标准混合溶液，按2.1～2.4优化后的方法处理样品。在最优化的色谱条件下平行测定，样品加标色谱图见图4，根据样品液的本底值和加标值，计算相应的回收率，如表3所示。

图4 加标样品色谱图Fig.4 THE chromatograms of add sample

表3 样品加标回收率与精密度（n=6）Table3 The recoveries and precision（n=6）

由表3可知，5种化合物平均回收率在82.4%～104.4%之间，RSD为1.7%～3.5%（n=6），结果表明该方法具有较高准确度及精密度。

2.7 样品测定

采用本文建立的方法，对随机购买的3份市售猪血豆腐用最优的样品前处理方法进行处理，并在最优的色谱条件下重复测定每个样品3次。5种待测物质均未被检出。样品色谱图见图5。

3 结论

图5 实际样品色谱图Fig.5 Chromatogram of the real sample

采用改进了的MSPD法对猪血豆腐中的4种镇静剂（艾司唑仑、阿普唑仑、氯氮、地西泮）及己烯雌酚残留进行样品前处理，该方法与传统基质固相分散萃取方法相比，省去了装填柱子的过程，仪器设备简单经济，同时采用混合分散剂不仅对样品进行了净化同时也可吸收了样品中的水分；该方法省时快速，步骤操作简单，有机溶剂使用量少；提取净化效率高、回收率、精密度较好，并结合采用高效液相色谱-紫外检测器检测，完全满足了试验灵敏度要求，可对猪血豆腐样品中的艾司唑仑、阿普唑仑、氯氮、地西泮及己烯雌酚残留同时进行快速检测。

[1]陈杖榴,杨桂香,孙永学.兽药残留的毒性与生态毒理研究进展[J].华南农业大学学报,2001,22(1):88-91

[2]王海娇,周艳明,牛森.高效液相色谱法测定猪肉中安定残留量[J].中国食品卫生杂志,2006,18(2):117-118

[3]张烁,周爽,陈达伟,等.畜肉中10种镇静剂残留的超高效液相色谱-串联质谱测定方法[J].分析测试学报,2014,33(11):1213-1218

[4]闫丽娟,张洁,潘晨松,等.超高效液相色谱-飞行时间质谱法高通量筛查乳制品中20种镇静剂[J].分析化学研究报告,2013,41(1): 31-35

[5]汪丽萍,李翔,孙英,等.气相色谱/质谱法测定猪肉中4中苯二氮类镇静剂残留[J].分析化学研究报告,2005,33(7):951-954

[6]付艳芳,李向梅,周建科.溶剂诱导分相微萃取/液相色谱法测定牛奶中雌激素[J].食品与发酵科技,2013(3):79-81

[7]周艳明,牛森.气相色谱法测定肉中己烯雌酚残留量[J].中国食品卫生杂志,2006,18(5):420-422

[8]张学亮,罗云敬,路勇,等.超高效液相色谱-串联四级杆质谱法同时测定牛肉与牛奶中20种性激素残留[J].分析测试学报.2015, 34(4):388-394

[9]邴爱英,成连贵,褚新星,等.己烯雌酚酶联免疫检测方法的建立[J].西南农业学报,2006,19(6):1159-1161

[10]Barker SA,Long AR,Short CR.Isolation of drug residues from tissues by solid phase dispersion[J].Journal of Chromatography A,1989, 475(2):353-361

Determination of Estrogen and Sedatives in Pig Blood Tofu Using Modified MSPD-HPLC Spectrometry

LUO Hui-yu1，XU Peng1，*，YAN Wei-wei1，CHEN Jian-hua2
（1.Zhangjiakou Food and Drug Inspection Center，Zhangjiakou 075000，Hebei，China；2.Xuanhua Iron and Steel Company Worker Hospital，Xuanhua075100，Zhangjiakou，China）

A method was established for the separation and determination of diethylstilbestrol and four sedatives（estazolam，alprazolam，chlordiazepoxide and diazepam）in pig blood tofu by modified solid-phase dispersive extraction with high performance liquid chromatography.The anhydrous sodium sulfate and florisil（the ratio of quality 4∶1）was the dispersing agent and clean-up reagent in the process of modified solid-phase dispersive extraction.The methanol was chose as the solvent.The estrogen and sedatives were separated on C18column（5μm，250mm×4.6mm i.d.）employing methanol∶acetonitrile∶water=30∶30∶40 as mobile phase and determined using UV detector at 235 nm.The column temperature was 30℃.The flow rate of mobile phase was 1.0 mL/min.The linearity was good in the range of 0.010μg/mL-10μg/mL with the correlation coefficients above than 0.999 2.The limit of detection of sedatives was 10 ng/g and the limit of detection of diethylstilbestrol was15 ng/g The average recoveries of estrogen were 82.4%to 104.5%.The relative standard deviations were 1.7%-3.5%.The method is simple，quick and inexpensive，which was available for the detection of diethylstilbestrol and sedatives in pig blood tofu.

MSPD；HPLC；pig blood tofu；narcotic；estrogen

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.032

2016-04-19

罗慧玉（1984—），女（汉），主管药师，大学本科，主要从事食品安全检测。

*通信作者：徐鹏，男，主管药师，硕士，主要从事食品安全检测。