二甲基苯蒽/佛波酯两步化学法诱导小鼠皮肤癌的模型优化

孙佳惠，单慧，潘萧羽，顾玉超*

(1.中国海洋大学医药学院，教育部海洋药物重点实验室，山东 青岛 266003；2. 青岛黄海学院基础教学部，山东 青岛 266427)

二甲基苯蒽/佛波酯两步化学法诱导小鼠皮肤癌的模型优化

孙佳惠1，单慧1，潘萧羽2，顾玉超1*

(1.中国海洋大学医药学院，教育部海洋药物重点实验室，山东 青岛 266003；2. 青岛黄海学院基础教学部，山东 青岛 266427)

目的 对两步化学诱导法建立BALB/c小鼠皮肤癌模型进行方法优化。方法 将BALB/c小鼠背部剃毛暴露出约2 cm×2 cm的皮肤，小鼠随机分为空白对照组和4个模型组，4个模型组第1周分别涂1、2、4、7次100 μg/100 μL DMBA/丙酮液，后续均1周涂两次4 μg/100 μL TPA/丙酮液，记录小鼠体重、成瘤时间、成瘤数量，并在12周后处死小鼠取肿瘤组织及瘤旁组织做HE染色分析。结果 1周涂1次DMBA成瘤周期长；1周两次成瘤周期短，质量高；1周4次会损伤皮肤但不影响肿瘤的形成；1周7次对皮肤伤害较大并导致小鼠死亡。结论 采用第1周涂两次DMBA启动，后续用TPA连续诱导建立BALB/c小鼠皮肤癌模型操作简便，成瘤期短，癌变率高，与人类皮肤癌发生发展相似，可用于建立研究皮肤癌较为理想的实验动物模型。

皮肤癌；两步化学法；小鼠；二甲基苯蒽；佛波酯

SUN Jia-hui1, SHAN Hui1, PAN Xiao-yu2, GU Yu-chao1*

皮肤癌系表皮角质形成细胞恶性增生的结果，是人类最常见的恶性肿瘤。动物模型已成为肿瘤相关研究的重要工具[1]。目前皮肤癌造模方法主要有化学诱发、光诱发[2]两种方法，最常用的是DMBA/TPA两步化学诱导法[3]。

本实验主要针对BALB/c小鼠的两步化学诱导皮肤癌造模方法进行了优化。虽然KM小鼠是我国生产量、使用量最大的远交群小鼠，且经常被用在皮肤癌造模中，但在前期使用KM小鼠的实验中我们发现，在诱导成瘤的过程中，其个体间差异较大，无法获得均一性很好的实验结果。因此，我们选择了近交系小鼠BALB/c进行了此次皮肤癌诱导条件的优化实验，鉴于BALB/c小鼠的基因纯合性和遗传稳定性，其有较为均一的表现型，且在肿瘤发病率、形态学特点、对药物的反应等方面的均衡一致要强于远交系小鼠。

另外，在前期使用BALB/c小鼠进行皮肤癌造模的实验中，我们发现采用经典的两步化学诱导法可以有效地诱导皮肤癌的发生。而且DMBA作为启动剂，在诱导皮肤癌发生的过程中发挥着至关重要的作用。但DMBA剂量过低，即使后续加大TPA剂量也很难诱导皮肤癌的发生，而过高的DMBA剂量又会对小鼠皮肤产生刺激，甚至伤害皮肤表层，使皮肤出现破损、结痂、发炎流脓的现象。因此，DMBA的涂药剂量对成瘤质量、成瘤时间、小鼠荷瘤数等有重要影响。由于BALB/c小鼠体型小、免疫力弱，更需要对BALB/c小鼠皮肤癌造模的最适DMBA给药量进行探究，以期用最合适的DMBA给药量，快速诱导出皮肤癌又尽量避免对小鼠皮肤的伤害，建立与肿瘤自发形成规律最贴合的皮肤癌模型以用于后续针对皮肤癌的科学研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物与饲养条件

4～5周龄雌性SPF级近交系BALB/c小鼠50只，体重12～16 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2012-0001]。整个过程按照SPF级动物饲养标准在青岛海洋生物医药研究院动物实验室进行饲养，[SYXK(鲁)2015-0011]。饲养条件：每笼5只。饲料：普通繁殖鼠料。温度：25～30 ℃。湿度：50%～70%。

适应性饲养1周后，全部小鼠背部备皮，暴露约2 cm × 2 cm皮肤，24 h后随机分组备用。

1.2 主要试剂

7，12一二甲基苯蒽(DMBA)分子式：C20H16，相对分子量：256.34，含量≥95%，产品编号 D3254。购自美国Sigma公司。佛波酯(TPA)分子式：C36H56O8，分子量：616.83，含量≥99%，产品编号P1585。购自美国Sigma公司。丙酮分子式：C3H6O，分子量：58.08，含量：≥99.0%，购自国药集团化学试剂有限公司。苏木素伊红(HE)染色试剂盒：产品编号: C0105，购自碧云天生物技术有限公司。其余试剂为市售分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及处理

50只BALB/c雌性小鼠，每组10只，计算机随机分为5组。正常对照组：背部皮肤用1 mL注射器每周2次涂抹丙酮溶液，每次100 μL；1号模型组：背部脱毛处理后，第1周涂1次(星期一)DMBA/丙酮液100 μg/100 μL，从第2周开始每周涂两次TPA/丙酮液，每次4 μg/100 μL。2号模型组：背部脱毛处理后，第1周涂两次(星期一、四，即隔3 d涂1次)DMBA/丙酮液100 μg/100 μL，从第2周开始每周涂两次TPA/丙酮液4 μg/100 μL。3号模型组：背部脱毛处理后，第1周涂4次(星期一、三、五、七，即隔2 d涂1次)DMBA/丙酮液100 μg/100 μL，从第2周开始每周涂两次TPA/丙酮液4 μg/100 μL。4号模型组：背部脱毛处理后，第1周每天涂1次DMBA/丙酮液100 μg/100 μL，从第2周开始每周涂两次TPA/丙酮液4 μg/100 μL。

所有小鼠每周背部脱毛1次。各组小鼠经上述处理后均继续观察至12周实验结束。所有小鼠异戊巴比妥钠麻醉后使用颈椎脱臼法处死。

1.3.2 一般观察

每天观察小鼠皮肤的改变及肿瘤生长情况；每周测量并记录小鼠体重及背部肿瘤的数量和瘤体直径，在鼠体平面示意图上标明部位，并拍照记录。肿瘤直径大于1 mm视为阳性。按体积计算方式(1)进行：

(1)

其中：A为肿瘤最大直径，B为垂直于A的直径。

描绘时间一平均荷瘤数动态变化曲线。肿瘤发生率=各组荷瘤动物数/该组存活动物数 × 100%；每鼠平均荷瘤数=各组小鼠乳头状瘤发生总数/该组存活小鼠数。

死亡小鼠为处理诱癌实验开始后非处死计划内死亡的小鼠，注意记录其死亡时间及数量，实验结束后计算小鼠死亡率。死亡小鼠经解剖观察其肝、肺及肠道等器官，了解其死亡原因，必要时行病理检查，明确死因。

1.3.3 肿瘤组织病理学染色

取背部荷瘤组织和非荷瘤组织各1 cm × 1 cm大小，迅速放入4%多聚甲醛中固定后常规石蜡包埋，进行连续石蜡切片，厚度3 μm。肿瘤组织染色采用HE染色法。

1.3.4 统计学处理

所有数据均运用SPSS 17.0统计软件分析。采用两因素析因设计定量资料的方差分析，组间分析采用两两比较的方法进行。数据表示为平均值±标准差(SD)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般观察

第1周对小鼠进行不同频率的皮肤癌诱发剂DMBA的涂抹后，第2周继续进行TPA涂抹时，3号、4号模型组涂药处出现了明显的毛发脱落，皮肤表层溃烂，皮下组织暴露、皱褶，继而流脓结痂(图1B)，3号模型组在第5周时涂药处结痂并逐渐脱落，但皮肤仍触摸略硬，第6周时基本恢复，与空白对照组小鼠背部皮肤无明显差异(图1A)。4号模型组在第3周时全部死亡，涂药处皮肤发黑，经鉴定应为皮肤遭到过度损伤后感染引发炎症，最终死亡。1号、2号模型组小鼠皮肤始终正常，无明显皮肤损伤现象。2、3号模型组在第4周开始出现肉眼可见肿瘤，而1号模型组于第7周开始成瘤(图1C)。

2.2 体重、肿瘤指标

经12周实验，模型组小鼠的体重变化率均低于空白对照组，3号模型组与空白对照组差异有显著性，而4号模型组由于DMBA剂量过大导致小鼠在实验周期内全部死亡(表1)。

本方法成瘤结果见表2，1个月后1号模型组肿瘤发生率为零，而2号模型组的肿瘤发生率略高于3号模型组，3个月后，2号模型组的肿瘤发生率最高，其次是3号模型组、1号模型组。这说明两步化学诱导法可成功诱导肿瘤的发生，但1周涂1次DMBA的1号模型组肿瘤发生比较晚，且部分小鼠直至实验结束也未能成瘤。1周涂4次DMBA的3号模型组虽然皮肤受到损伤，但仍有肿瘤的发生，但肿瘤发生率低于1周涂两次DMBA的2号模型组。

由时间—平均荷瘤数动态变化曲线(图2)也可直观地看出，1号模型组成瘤时间明显晚于2号、3号模型组，2号、3号模型组成瘤时间相似，但3号模型组的成瘤率又明显低于2号模型组，这证明2号模型组无论是在成瘤时间还是成瘤数量上都明显优于其他，这与之前的结论是相一致的。

表1 小鼠体重变化

注：与空白对照组比较，**为P<0.01

Note. Compared with the control group:**P<0.01.

表2 小鼠背部肿瘤组织生长情况

注：A. 正常皮肤；B. 皮肤流脓结痂；C. 皮肤成瘤。图1 小鼠皮肤一般观察Note. (A) Healthy skin. (B) Suppuration and eschar in the skin. (C) Skin tumors.Fig.1 Gross appearance of the mouse skin

注：A. 皮肤肿瘤；B. 正常皮肤。 图3 小鼠皮肤组织镜下观察 (HE染色，×4)Fig.3 Histology of the mouse skin. (A) Skin tumor. (B) Heathy skin. HE staining，×4

图2 对照组和模型组小鼠时间-平均荷瘤数动态变化曲线Fig.2 The dynamic growth curve of time-tumor number in the control and model groups

2.3 病理学检测

诱导性肿瘤的发展过程主要分为乳头状瘤1, 2, 3期，微浸润性鳞状细胞癌1， 2, 3期及完全浸润鳞状细胞癌。经12周诱导后处死小鼠，取背部荷瘤组织及瘤旁组织进行HE染色发现，所诱导肿瘤基本都处于乳头状瘤3期(图3)。

3 讨论

皮肤癌是皮肤恶性肿瘤的统称，各国皮肤癌发病率差异较大，其中白色人种发病率较高，如新西兰就是其中之一。在我国以沿海地区及高山地区较多见。近年来，因臭氧层破坏加重，造成全球范围内皮肤癌发病率逐年上升，并呈年轻化趋势。因此，皮肤癌防治已成为皮肤病研究领域的热点[4]。

小鼠皮肤癌模型是最为简便的小鼠肿瘤模型，而化学诱导法也最为接近日常致癌剂的接触而导致癌症发生的过程，因此小鼠化学诱导法皮肤癌肿瘤模型是研究一些抗肿瘤药物药效的最为常用的一种肿瘤模型[5]。DMBA/TPA模型模拟的是鳞状细胞癌的发生，该模型用DMBA作为启动剂，在致癌基因Ha-ras的第61个密码子上使A突变成T，造成不可逆转的特异性突变，用于皮肤癌的初始化。TPA作为促癌剂，促进肿瘤的生长[6,7]。两步法诱导产生的大多是乳头状瘤，本次实验的病理检测结果也表明所诱导肿瘤基本都处于诱导性肿瘤分期中的乳头状瘤3期。

本实验针对两步化学诱导皮肤癌造模方法进行了优化，采用遗传背景单一的BALB/c小鼠作为实验鼠。实验结果表明，DMBA对BALB/c小鼠的皮肤有显著地刺激作用，并且DMBA的涂药剂量对成瘤质量、成瘤时间、小鼠荷瘤数等有重要影响。第1周涂DMBA 1次，2次，4次均可以诱导成瘤，但涂7次可以使BALB/c小鼠皮肤溃烂致死。其中第1周涂DMBA两次对小鼠皮肤影响不大，且1个月即可成瘤，成瘤时间短，肿瘤发生率高。该皮肤癌优化模型造模时间短，成瘤率高，个体间差异小，实用性强，对需要皮肤癌小鼠模型的实验有重要的参考价值，对临床防治皮肤癌的研究也具有重要应用意义。

[1] 饶子亮，黄威，郑佳琳，等．两种人乳腺癌裸鼠移植模型的建立 [J]．中国比较医学杂志，2012，22(5): 5-8．

[2] 王红丽，陈苑，胡银霞，等. 皮肤光损伤肿瘤模型的建立 [J]. 中国比较医学杂志，2013，23(9): 49-51.

[3] Aldaz CM, Conti CJ, Chen A, et al．Promoter independence as a feature of most skin papillomas in SENCAR mice [J]. Cancer Res. 51(3): 1045-1050.

[4] Abel EL，Angel JS，Kiguehi K，et al. Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin：Fundamentals and applications [J]．Nat Protoc，2009，4(9): 1350-1362．

[5] Ishikawai T，Kumar IP，Machado HB，et al. Positron emission tomography imaging of DMBA/TPA mouse skin multi-step tumorigenesis [J]．Mol Oncol，2010，4(2): 119-125.

[6] Carver BS, Pandolfi PP．Mouse modeling in oncologic preetinical and translational research [J]．Clin Cancer Res，2006，12(18): 5305-5311．

[7] Kemp CJ. Multistep skin cancer in mice as a model to study the evolution of cancer cells [J]. Semin Cancer Biol, 2005, 15: 460-473.

Optimization of the establishment protocol of a mouse model of

MBA/TPA-induced skin cancer

(1. School of Medicine and Pharmacy, Ocean University of China; Key Laboratory of Marine Drugs, Ministry of Education; Qingdao 266003, China; 2. Basic Teaching Department of Qingdao Huanghai University, Qingdao 266427)

Objective To induce skin cancer in BALB/c mice using DMBA as initiator and TPA as tumor promoter. Through optimizing the doses and frequencies of DMBA administration to establish a stable skin cancer model with less time and causing less skin damage. Methods Shaving the back of mice to expose a piece of skin around 2 cm × 2 cm. The mice were divided into a blank control group and four treatment groups randomly. These four groups were given 1, 2, 4, 7 times 100 μg/100 μL DMBA/acetone, respectively, in the first week, and twice 4 μg/100 μL TPA/acetone per week in the next 11 weeks. The body weight changes, time of tumor formation and number of tumors formed were recorded during the experiment. The mice were sacrificed at 12th week and samples of tumor tissue and adjacent normal skin tissue were taken for pathological examination using HE staining. Results Tumors were observed at the 7th week in the group with once DMBA administration in the first week and at the 4th week in the group with twice DMBA administration in the first week. Skin cancers were formed also in the group with 4-time DMBA administration in the first week, however, with significantly more severe skin damages. The mice receiving DMBA everyday in the first week died at the 3th week. Conclusions The best induction protocol for skin cancer in BALB/c mice should be twice DMBA in the first week followed by twice TPA in the next few weeks. This protocol has the advantages of easy operation, short modeling time, high cancer formation rate, and presents a similar process of human skin carcinogenesis, thus, it can be used as a useful animal model for skin cancer research.

Skin cancer; Multi-step tumorigenesis; Mice; DMBA; TPA

GU Yu-chao， E-mail: guych@126.com

国家自然科学基金项目(项目编号81272264)；中央高校基本科研业务费(201562028)。

孙佳惠(1993-)女，硕士研究生，研究方向：药理学。Email: pharmacy_sjh@163.com

顾玉超(1981-)男，副教授，Email: guych@126.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 01-0031-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.01.006

2016-06-07