波动性高糖对血管平滑肌细胞增殖及凋亡蛋白表达的影响

张甜甜，丁颖超，苏 宁，任建民

(1.山东寿光市人民医院， 山东 潍坊 262700； 2.山东大学齐鲁医院， 山东 泰安 271041)

波动性高糖对血管平滑肌细胞增殖及凋亡蛋白表达的影响

张甜甜1，丁颖超1，苏 宁1，任建民2

(1.山东寿光市人民医院， 山东 潍坊 262700； 2.山东大学齐鲁医院， 山东 泰安 271041)

目的分析血管平滑肌细胞增殖和凋亡蛋白表达受到波动性高糖影响的过程。方法利用持续高糖及波动性高糖的方式促使大鼠胸主动脉平滑肌持续孵育二十四小时，重点采用MTT方法检测血管平滑肌细胞的增殖活性，同时还需要关注流式细胞术对检测细胞周期过程中发生的具体改变，利用Western bloting手段检测胞浆中Bcl-2与Bax蛋白的表达。结果发现波动性高浓度葡萄糖培养相比于持续高浓度葡萄糖的培养方式更有助于提升血管平滑肌细胞的增殖活性，并且有效的实现周期转变，促使G0/G1期及时向S期进行转变，在上调Bcl-2/Bax比值的过程中，更好的呈现出提高活性效果。结论 波动性高葡萄糖能够通过干预细胞周期的方式，对凋亡蛋白加以调控，从而更好的促进血管平滑肌细胞出现不断增殖的现象，并且逐渐诱导其进入凋亡状态，相较于持续性高葡萄糖，可以更加明显的促进糖尿病动脉粥样硬化的发展延伸。

波动性高糖；细胞增殖；凋亡蛋白表达；血管平滑肌细胞

糖尿病患者会发生慢性血管并发症主要是跟持续高糖有关，同时也和血糖波动联系密切[1]。动脉粥样硬化属于DM患者发生大血管病变中的重要病理基础，内皮细胞与血管平滑肌细胞等成分都是在As发生过程中体现出重要价值。此次研究主要是以大鼠胸主动脉平滑肌细胞株A7r5为对象，目的是探索波动性高糖对VSMC的增殖及凋亡，以及可能产生的作用与相关机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

大鼠胸主动脉平滑肌细胞株A7r5细胞；Epics-XLⅡ型流式细胞仪(BeckmanCoulter公司)；高糖DMEM培养基、低糖DMEM培养基、胎牛血清(GIBCO公司)；鼠单抗Bclxl抗体(eBioscience公司)；兔抗人 β-actin多克隆抗体(Santa Cruz公司)；鼠单抗Bcl-2抗体、鼠单抗Bax抗体(杭州四季青生物工程公司产品)。

1.2 细胞培养和实验分组

把细胞培养在四十八小时之内更换含无血清的培养基进行培养二十四小时，让细胞可以同步于G0/G1期，然后分3组：①正常对照组：5.5 mmol/L葡萄糖组；②持续高糖组：25 mmol/L葡萄糖组；③波动性高糖组：白天5.5 mmol/L葡萄糖和25 mmol/L葡萄糖每3 h高糖2 h低糖交替3次，高糖过夜。培养24 h。

1.3 MTT法检测细胞增殖活性

流式细胞仪检测细胞周期分布；Western bloting法检测细胞Bcl-2和Bax蛋白表达。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 血管平滑肌细胞的具体增殖情况

波动性高糖组VSMC A490值相比于正常的对照组，会发现持续高糖组都显著升高(均P＜0.01)；持续高糖组A490值相比于正常对照组也呈现出明显增加的趋势(P＜0.01) (表1略)。

2.2 细胞生长周期比较

不同浓度的葡萄糖在经过二十四小时作用VSMC之后，波动性高糖组及持续高糖组S期细胞百分比相比于正常对照组要呈现出明显的增高趋势(P分别＜0.01，0.05)，波动性高糖组相比于持续高糖组呈现出增高(P＜0.05)趋势；波动性高糖组G0/G1期细胞百分比相比于持续高糖组和正常对照组呈现出降低的趋势(P分别＜0.01，0.005)，而持续高糖组G0/G1期细胞百分比和正常的对照组进行比较发现差异无统计学意义。各个组间G2期细胞百分比相比体现不出统计学意义(表2略)。

2.3 不同葡萄糖浓度的影响

和正常对照组进行对比，发现波动性高糖组和持续高糖组Bcl-2和Bax蛋白的表达都呈现出增强(均P＜0.01)的趋势，波动性高糖组Bcl-2和Bax蛋白表达也明显高于持续高糖组(P分别＜0.05，0.01)；波动性高糖组和持续高糖组Bcl-2/Bax之间的比值明显高于正常对照组(均P＜0.01)，波动性高糖组Bcl-2/Bax比值相比于持续高糖组呈现出显著增高(均P＜0.01；表3和图1)的趋势。

3 讨论

糖尿病就是慢性高血糖为特征的代谢紊乱综合征，如果大血管发生病变会引起心脑血管疾病的发生，甚至是致死致残。高血糖与心脑血管疾病联系密切，糖化血红蛋白在逐渐升高1%的时候，1型和2型糖尿病患者的心脑血管疾病呈现出的危险性也会逐渐增加15%和18%，显示出的高血糖状态就是糖尿病患者发生心脑血管疾病的成因。

此次研究证实，持续体外高糖培养能够刺激VSMC细胞的增殖，从而改变细胞在不CN 43-1262/R中国动脉硬化杂志2011年第19卷第11期899同周期的百分比，和以往研究的结果相符。

此研究在VSMC上证实，波动性高葡萄糖会通过细胞周期转化、调控凋亡蛋白的表达增加细胞增殖，避免出现凋亡情况，这对细胞功能损伤较之持续性高糖更加严重。为此，控制好具体的血糖水平，能够减少血糖波动对控制糖尿病大血管并发症的延续，以此对提升患者的生存质量具有重要意义。

[1] 邓珊珊，刘 红，荣 曦，等.波动性高糖对INS-1细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响[J].山东医药，2012，(15)：12-14.

[2] 冯朝彩，赵占胜，李 丹，等.波动性高糖对血管平滑肌细胞增殖及凋亡蛋白表达的影响[J].中国动脉硬化杂志，2011，(11)：897-900.

[3] 汤智敏，雷闽湘.波动性高糖诱导的内皮细胞凋亡与JNK信号转导途径[J].中南大学学报(医学版)，2010，(06)：616-621.

本文编辑：贺 攀

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ISSN.2095-8242.2017.12.2196.01