血清miRNA-210和miRNA-21联合检测对NSCLC的临床应用价值

周金林，邓述恺

(1.西南医科大学研究生院临床医学系，四川泸州 646000;2.四川省巴中市中心医院呼吸内科 636000)

血清miRNA-210和miRNA-21联合检测对NSCLC的临床应用价值

周金林1,2，邓述恺1△

(1.西南医科大学研究生院临床医学系，四川泸州 646000;2.四川省巴中市中心医院呼吸内科 636000)

目的 探讨血清miRNA-210和miRNA-21联合检测对非小细胞肺癌(NSCLC)的临床应用价值。方法 选择四川省巴中市中心医院确诊的NSCLC患者48例(NSCLC组)，另选择肺良性病变患者40例、健康体检者40例作为对照研究，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测血清miRNA-210和miRNA-21水平。结果 NSCLC患者血清miRNA-210和miRNA-21水平明显高于肺良性病变和健康体检者(P<0.05)；血清miRNA-210在腺癌、T3～4期患者高表达(P<0.05)，miRNA-21在腺癌、T3～4期、吸烟患者高表达(P<0.05)；血清miRNA-210、miRNA-21诊断NSCLC的受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)分别为0.845、0.725，二者联合AUC为0.928(P=0.021)；COX多因素回归分析显示，血清miRNA-210(RR：1.977，95%CI：0.985～3.018，P=0.009)和miRNA-21(RR：1.853，95%CI：0.921～2.776，P=0.018)对NSCLC患者预后有一定预测价值。结论 miRNA-210和miRNA-21在NSCLC患者血清高表达，二者联合检测可能对NSCLC有一定诊断效能，并对预后有一定提示作用。

癌，非小细胞肺；微RNA；血清

肺癌是常见恶性肿瘤，其发病率和病死率在世界范围内呈逐年增加的趋势，已成为威胁人类生命健康的主要疾病之一。肺癌按照病理分型可分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，而NSCLC占肺癌总发病的80%左右[1]。NSCLC发病隐匿、早期症状不明显，多数患者发现时已经进展至中、晚期，加之病情复杂、进展快，虽然近年来的治疗手段越来越多样化，但是其5年生存率并不理想，仅有15%～20%[2]。提高NSCLC的诊断效率对治疗、预后有积极意义[1-3]。常用诊断NSCLC的方法有影像学、细胞学、肿瘤标志物检查等，病理活检是肺癌诊断的金标准，但是通过纤支镜或胸壁针取得组织标本是一个有创过程，容易引起组织损伤或癌细胞沿穿刺针道扩散，一般只在高度怀疑的情况下做确诊使用[4]。目前提倡对肿瘤患者通过高效、无创的检查手段进行诊断和预后判断，微RNA(microRNA，miRNA)血清学检测正是这样一种经济、简单、有效的诊断方法。恶性肿瘤的发生、进展被认为与miRNA表达失衡有关[5]，最初的研究认为miRNA仅在肿瘤组织异常表达，发挥促癌或抑癌作用，但是随着研究的深入，发现miRNA失衡表达在外周循环血也有体现，并且可以此作为肿瘤诊断的生物标志物[6]。本研究对48例NSCLC患者进行血清miRNA-210和miRNA-21水平检测，分析其与NSCLC发病的关系、诊断价值和预后判断。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择四川省巴中市中心医院呼吸内科2012年1月至2014年1月确诊的NSCLC患者48例(NSCLC组)，其中男28例，女20例；年龄37～69岁，中位56岁；参考WHO制定的细胞分类法：腺癌33例，鳞癌15例；临床分期：T1～2期30例，T3～4期18例。纳入标准：(1)所有病例均经病理学诊断确诊为NSCLC；(2)具备完整的临床诊断、治疗资料；(3)取得待测标本前患者均未经过放疗、化疗及生物制剂等治疗。排除标准：(1)患者出现呼吸困难等可能导致体内缺氧的症状；(2)患者患严重心、肝、肾及代谢性疾病，或出现严重恶病质。另选择肺良性病变患者40例(良性病变组)，其中男25例，女15例；年龄40～72岁，中位58岁；肺大疱者18例，结核瘤12例，炎性假瘤10例。健康体检者40例(对照组)，其中男25例，女15例；年龄35～68岁，中位56岁。3组对象在性别、年龄等比较中差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过医院伦理委员会审批，所有患者均知晓本研究目的、过程和意义，并同意参与，签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂与仪器 ABI-7300荧光定量PCR仪(ABI公司，美国)、血清RNA提取试剂盒(Applied Biosyste公司，美国)、荧光定量PCR试剂盒(北京艾德莱生物)、引物设计与合成(上海生工)。

1.2.2 标本采集 采集NSCLC患者入院第2天、未行任何放疗、化疗及生物制剂等治疗前，以及肺良性病变患者、健康体检者，清晨空腹静脉血5 mL，室温静置15～30 min，4 ℃、3 500 r/min离心10 min，取血清于洁净1.5 mL离心管，-80 ℃冰箱保存待测。

1.2.3 cDNA合成 严格按照血清RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，分光光度仪检测260/280吸光度，1.8～2.2为合格标本，可进行下一步逆转录。逆转录反应体系：1 μg RNA，5×RT缓冲液5 μL，10 mmol/L dNTP 0.75 μL，40 U/μL RNA酶抑制剂0.25 μL，200 U/μL逆转录酶0.2 μL，其余以去离子水补足至20 μL。PCR仪设置逆转录条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，75 ℃ 15 min，待转录结束后置于-20 ℃冰箱备用。

1.2.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测 以定量荧光PCR仪使用miRNA Real-time PCR实时荧光定量反应试剂盒进行扩增反应，以U6为内参检测目的基因相对表达水平，U6、miRNA-210、miRNA-21引物序列见表1。反应体系：cDNA产物1.0 μL，2×miRNA qPCR Mix10 μL，Forward primer 0.4 μL，Reverse primer 0.4 μL，余用双蒸水(ddH2O)水补齐至20 μL。扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性20 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸40 s，共40个循环，所有反应设立3个复孔。根据各样品RT-qPCR曲线得到Ct值，Ct值表示荧光达到阈值所需要的循环数。血清miRNA水平采用相对表达量2-△Ct描述，△Ct=Ct miRNA-Ct U6，表示目的基因相对于内参基因表达水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件统计包进行统计学分析，正态性分布检验显示miRNA水平2-△Ct呈非正态分布，所以采用中位数及四分位数(25%分位数～75%分位数)描述。NSCLC患者、肺良性病变患者、健康体检者组间血清miRNA水平采用Wilcoxon符号秩和检验；NSCLC患者病理特征与血清miRNA水平的关系采用MannWhitneyU检验；血清miRNA对NSCLC诊断效能采用受试者工作特征(ROC)曲线分析；采用Kaplan-Meier法分析患者疾病无进展生存时间(PFS)；采用COX比例风险回归模型进行多因素生存分析；均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同组间血清miRNA表达水平比较 NSCLC组患者血清miRNA-210相对表达水平为1.68(0.92～1.94)，良性病变组患者相对表达水平为0.93(0.38～1.31)，对照组相对表达水平为1.02(0.40～1.29)，NSCLC组患者表达水平明显升高(P<0.05)，良性病变组与对照组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。在血清miRNA-21相对表达水平比较中，NSCLC组患者为9.23(5.17～14.02)，良性病变组患者为4.17(1.39～7.21)，对照组为3.83(1.22～6.88)，NSCLC组患者表达水平明显高于良性病变和对照组(P<0.01)，而良性病变与对照组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

表1 引物序列

图1 3组对象血清miRNA-210、miRNA-21水平比较

2.2 NSCLC患者临床特征与血清miRNA水平的关系 血清miRNA-210在腺癌、T3～4期高表达(P<0.05)，而与年龄、性别及是否吸烟无明显关系(P>0.05)；血清miRNA-21在腺癌、T3～4期、吸烟患者高表达(P<0.05)，而与年龄、性别无明显关系(P>0.05)，见表2。

表2 不同临床特征NSCLS患者血清miRNA水平比较

续表2 不同临床特征NSCLS患者血清miRNA水平比较

图2 miRNA对NSCLC诊断的ROC曲线分析

图3 PFS生存曲线分析

2.3 miRNA联合检测对NSCLC的诊断效能 通过ROC曲线分析显示，血清miRNA-210的曲线下面积(AUC)为0.845，敏感性为74.10%，特异性为78.20%；miRNA-21的AUC为0.725，敏感性为69.70%，特异性为77.60%；而miRNA-210、miRNA-21联合检测AUC为0.928，敏感性为82.40%，特异性为80.50%。提示血清miRNA-210和miRNA-21对NSCLC均有一定诊断效能，而二者联合检测对NSCLC诊断效能更佳(P=0.021)，见图2。

2.4 PFS生存曲线分析 根据ROC曲线最大约登指数得出血清miRNA-210最佳诊断临界值2-△Ct为1.60，miRNA-21最佳诊断临界值2-△Ct为10.01，以此分为高表达组与低表达组。结果显示miRNA-210 高表达患者中位PFS为9.20月，低表达患者中位PFS为14.80月，两组比较差异有统计学意义(P=0.031)；miRNA-21高表达患者中位PFS为10.00月，低表达患者中位PFS为15.30月，两组比较差异有统计学意义(P=0.028)，见图3。

2.5 患者预后因素分析 对患者PFS进行COX多因素回归分析，结果显示血清miRNA-210和miRNA-21表达、组织类型、T分期均与患者中位PFS显著相关，血清miRNA-210(RR：1.977，95%CI：0.985～3.018，P=0.009)和miRNA-21(RR：1.853，95%CI：0.921～2.776，P=0.018)可能是NSCLC患者预后的独立危险因素，见表3。

表3 NSCLC患者预后多因素分析

3 讨 论

miRNA是一类广泛存在于真核细胞、进化保守、长度约为20～22个核苷酸的单链非编码小分子RNA，可以抑制RNA翻译或者导致序列特异性靶mRNA降解，以调控分化、增殖、凋亡等细胞生物学行为[7]。研究显示，占比不到人类基因组3%的miRNA却参与了多达30%的基因调控，超过50%的miRNA位于恶性肿瘤相关基因调控区域内，体内miRNA失衡可能是肿瘤发生的重要机制之一[5]。NSCLC发病机制复杂，miRNA可能通过多种途径影响其发生与进展，如miRNA-449a在NSCLC低表达[8]，可能发挥抑癌作用，miRNA-214在NSCLC高表达[9]，可能扮演促癌的角色，而miRNA-125b可能与NSCLC耐铂类药物化疗相关[10]。外周循环血存在大量miRNAs，其稳定性高、轻易不被降解，多数来自循环肿瘤细胞或肿瘤组织，常常提示相关基因的异常表达，对肿瘤早期诊断、分期、预后有一定预见作用。Chen 等[11]通过RT-PCR对400 例 NSCLC患者和220例健康对照者血清miRNA水平检测，在2个阶段的选择、验证分析后，证实miRNA-20a、miRNA-24、miNA-25等10个miRNA与健康对照者存在显著差异性表达。表明血清miRNA检测可以作为NSCLC无创诊断的潜在生物标志物。

本研究选择miRNA-210和miRNA-21作为NSCLC诊断的目标miRNA，既往研究多以肺癌组织两种miRNA表达失衡为研究切入点，而两种miRNA在NSCLC患者血清学水平联合检测的价值则鲜见报道。miRNA-210受缺氧诱导因子1(HIF-1)调节，在细胞对缺氧的应答过程中发挥重要作用，如血管生成、细胞周期调节、DNA修复等，在肿瘤发生、发展过程中具有多面性，既可以表现为促癌作用，也可以抑制肿瘤进展[12]。Osugi等[13]对80例通过外科手术治疗的NSCLC患者miRNA-210表达进行分析，证实miRNA-210在肿瘤组织高表达，并且和淋巴结转移、临床分期等相关，在腺癌组织过表达尤其显著，提示miRNA-210可能在NSCLC发病过程起到促癌基因作用。miRNA-21失衡表达也与NSCLC发病关系密切，Xie等[14]从NSCLC患者痰液中提取miRNA-21进行定量分析，发现miRNA-21表达明显升高。Wang等[15]通过实验发现，在沉默miRNA-21后可以阻断肺癌A549细胞周期进程，降低细胞增殖能力，表明miRNA-21可能与肺癌进展相关；其团队对NSCLC肿瘤组织检测后证实，miRNA-21显著高表达，并且与淋巴结转移、不良状态和危险预后呈正相关。本研究结果显示，NSCLC组患者血清miRNA-210和miRNA-21水平明显高于良性病变组和对照组(P<0.05)，而良性病变组和对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示miRNA-210和miRNA-21可能作为促癌基因在NSCLC发挥作用，其血清水平过表达可能是NSCLC诊断的潜在生物标志物。进一步分析发现，NSCLC患者miRNA-210和miRNA-21血清水平与临床病例特征相关：血清miRNA-210在腺癌、T3～4期患者表达明显升高(P<0.05)，而miRNA-21则在腺癌、T3～4期、吸烟患者呈高表达状态(P<0.05)。以上结果表明，miRNA-210、miRNA-21不但参与NSCLC发病，并且可能还与肿瘤细胞转移、侵袭等有一定关系，对临床分期、组织分型有一定提示作用[13,15]。

本研究将miRNA-210和miRNA-21血清水平作为NSCLC诊断标志物，通过ROC曲线分析其诊断效能，结果显示miRNA-210、miRNA-21可能对NSCLC有一定诊断价值，而二者联合应用可能有更佳的诊断效能。Zhao等[16]的研究显示，血清miRNA-21诊断NSCLC的AUC为0.812，敏感性73.8%，特异性71.1%。Zhu等[17]对112例NSCLC患者多种miRNA血清水平诊断价值进行研究，发现miRNA-210对NSCLC患者早期有较好的诊断价值，尤其联合miRNA-182、 miRNA-183、miRNA-126检测时AUC可以达到0.965，敏感性为81.3%，特异性为100%，其诊断价值明显高于癌胚抗原(CEA)。本研究结果与其类似，也提示单独一种miRNA用于诊断NSCLC能力有限，而多种miRNA联合检测则可以明显提升诊断效率。

miRNA具有调控细胞生物学行为的能力，其失衡表达可以通过对细胞行为的改变而表现出机体不适应性。对恶性肿瘤而言，miRNA失衡表达可能会影响患者预后。Wang等[18]对16篇报道文献的7种不同恶性肿瘤miRNA-210表达与预后关系进行Meta分析，发现miRNA-210高表达对乳腺癌、膀胱癌等生存时间有明显负性影响。miRNA-21在食管鳞状细胞癌患者高表达被认为与PFS、总生存时间缩短有明显关系[19]。既往研究认为miRNA-210和miRNA-21可能与Ⅰ期NSCLC复发相关[20]。Donnem等[21]从335例NSCLC石蜡埋样标本选取10例长生存期和10例短生存期标本做miRNA分析，发现miRNA-210和miRNA-21在短生存期患者明显高表达，这可能与二者是肿瘤血管生成miRNA有关。本研究以ROC曲线得出临界值，证实miRNA-210、miRNA-21血清高表达患者中位PFS均显著低于低表达患者(P<0.05)，显示miRNA-210、miRNA-21与疾病进展可能存在一定关系。对PFS进行COX多因素回归分析发现，血清miRNA-210(RR：1.977，95%CI：0.985～3.018，P=0.009)和miRNA-21(RR：1.853，95%CI：0.921～2.776，P=0.018)均是预测NSCLC患者PFS的独立危险因素。进一步证实miRNA-210、miRNA-21可能与疾病进展有关，可能是NSCLC患者预后的独立危险因素。

综上所述，NSCLC患者血清miRNA-210和miRNA-21水平呈高表达状态，与临床特征有一定关系，二者联合检测可能对NSCLC的诊断有一定价值。miRNA-210、miRNA-21可能是NSCLC患者预后的独立危险因素。本研究存在标本量小、无基础机制研究等缺陷，结果存在一定局限性，但是对血清miRNA用于NSCLC诊断、治疗和预后评估具有积极的探索意义，而血清miRNA检测用于NSCLC诊断还需要大样本量的数据支持，有待进一步深入研究和探讨。

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Clinical application value of combined detection of serum miRNA-210 and miRNA-21 in non small cell lung cancer

ZhouJinlin1,2,DengShukai1△

(1.FacultyofClinicalMedicine,GraduateSchool,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China; 2.DepartmentofRespiration,BazhongMunicipalCentralHospital,Bazhong,Sichuan636000,China)

Objective To investigate the clinical value of combined detection of serum miRNA-210 and miRNA-21 in non small cell lung cancer (NSCLC).Methods Forty-eight patients with NSCLC in the Bazhong Municipal Central Hospital were selected as the research subjects.Forty patients with benign lung diseases and 40 individuals undergoing healthy physical examination were selected as the control groups.The levels of serum miRNA-210 and miRNA-21were detected by RT-qPCR.Results The levels of serum miRNA-210 and miRNA-21 in the patients with NSCLC were significantly higher than those in the patients with benign lung diseases and healthy controls(P<0.05);serum miRNA-210 was highly expressed in adenocarcinoma and T3-4stage patients(P<0.05) and miRNA-210 was highly expressed in adenocarcinoma,T3-4stage and smoking patients(P<0.05);the area under the ROC curve(AUC) of miRNA-210 and miRNA-21 for diagnosing NSCLC was 0.845 and 0.725 respectively,but AUC of their combination was 0.928(P=0.021);COX multivariate regression analysis showed that serum miRNA-210(RR：1.977，95%CI：0.985-3.018，P=0.009)and miRNA-21(RR：1.853，95%CI：0.921-2.776，P=0.018)had some predictive value for the prognosis in the patients with NSCLC.Conclusion MiRNA-210 and miRNA-21 are highly expressed in serum of the patients with NSCLC.Their combined detection can have a certain diagnostic efficiency for NSCLC and have a certain prompt action on the prognosis.

carcinoma,non-small-cell lung;microRNA;serum

��·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.014

周金林(1985-)，主治医师，在读硕士研究生，主要从事肺癌的发病机制和临床治疗研究。△

，E-mail:dsk_lan@163.com。

R734.2

A

1671-8348(2017)07-0908-05

2016-08-26

2016-11-11)