肌萎缩侧索硬化患者脑脊液和血液生物学标志物的研究进展

任雨婷 综述 黄旭升 审校



肌萎缩侧索硬化患者脑脊液和血液生物学标志物的研究进展

任雨婷 综述 黄旭升 审校

肌萎缩侧索硬化；脑脊液；生物学标志物；血液；发病机制

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一种选择性累及上、下运动神经元的神经系统变性疾病。ALS早期诊断主要依靠临床症状并结合针极肌电图检查，因多数患者诊断延误，使其失去早期药物干预的时机。生物学标志物是近年来随着免疫学和分子生物学技术的发展而提出的一类与细胞生长增殖有关的标志物。通过探索与疾病相关的生物学标志物，可对疾病诊断和疗效评估提供理论依据和治疗靶点，也可为监测疾病进展提供客观参考。发现ALS生物学标志物对于阐明发病机制，进而理解ALS病理生理过程具有重要意义。现从脑脊液和血液两方面进行综述。

1 脑脊液检查

脑脊液与脑组织的细胞外液及神经细胞直接接触，与血清、血浆和尿液等其他体液相比，对于反映神经元丢失或突触形成障碍有关的病理改变具有更高的敏感性。

1.1 神经轴突损害相关标志物 (1)神经微丝蛋白(neurofilament, NF)：为成熟神经元细胞骨架的主要成分。部分ALS患者脑脊液中，NF轻链和磷酸化NF重链含量升高，其中以上运动神经元损害为主的患者神经丝重链升高为著，可能是由于上运动神经元损害引起沿脊髓走行的粗轴索变性, 从而导致大量NF释放到脑脊液中，脑脊液中NF轻链蛋白水平与上运动神经元损害程度及疾病进展速度相关[1]。研究发现，ALS患者脑脊液中磷酸化NF重链较对照组明显增高，其诊断敏感性和特异性分别为90%和87%，提示磷酸化NF重链有望成为诊断疾病和提示预后的生物学标志物[2]。(2)tau蛋白：是一种神经元微管相关蛋白，广泛分布于神经元内，在脑内主要集中在神经细胞轴突中。有学者认为，脑脊液中tau蛋白在ALS早期增加，后期正常[3]。Grossman等[4]发现，脑脊液磷酸化tau蛋白(p-tau)与总tau蛋白比率可为ALS诊断提供客观支持。据报道，ALS患者脑脊液中p-tau显著降低，亦有报道p-tau无明显下降[5]。因此，脑脊液中p-tau作为ALS诊断性标志物尚有争议。(3)淀粉样-β(1-42)：通过形成不溶性斑块从而引起神经变性。ALS患者脑脊液中该蛋白较正常对照浓度低[6]。

1.2 神经胶质激活或神经胶质增生相关标志物 神经轴索变性级联反应早期会出现神经胶质细胞激活，相关标志物包括红细胞生成素(EPO)、S100β、谷氨酰胺合成酶等[4]。(1)S100β蛋白：是星形胶质细胞及少突胶质细胞中最丰富的酸性钙结合蛋白，为星形胶质细胞病变的生物学标志物。ALS患者脑脊液中S100β浓度因不同运动神经元病亚型而异，相较于ALS和以上运动神经元受累为主的患者，以下运动神经元受累为主的患者S100β水平较低。脑脊液中S100β水平下降提示预后较好，生存期较长。ALS患者血清中其水平下降[7]。(2)促红细胞生成素(EPO)： ALS早期阶段脑脊液中EPO含量减低，呼吸肌受累者EPO水平明显升高，对早期诊断和判断呼吸肌受累具有提示作用[8]。(3)谷氨酰胺合成酶： ALS患者脑脊液和血清中谷氨酰胺合成酶水平升高，在其他神经系统疾病中其活性亦，故其临床指导价值较小。

1.3 氧化应激相关标志物 (1)3-硝基络氨酸(3-NT)： ALS患者脑脊液中3-NT水平增高，此改变亦可见于其他神经系统变性疾病[9]，故其应用价值有限；(2)8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-OHdG)：DNA修饰的标志物，可反映氧化应激的过程和结果，ALS患者脑脊液中8-OHdG水平增加，与疾病严重程度或病程无相关性[10]；(3)SOD1活性：目前关于ALS患者脑脊液中SOD1活性的报道结果不一，因此其临床指导价值较小[4]；(4)NO3-：是一种产生自由基的物质，可引起一氧化氮生物转化并产生游离铁，研究报道ALS患者脑脊液中NO3-水平无明显改变[11]；(5)4-羟基-2,3-壬烯酸(4-HNE)：一种脂质过氧化产物， ALS患者脑脊液和血清中4-HNE水平明显升高，并与疾病严重程度成正相关[12]；(6)氧化蛋白相关产物： ALS患者脑脊液和血浆中氧化蛋白含量(AOPP，氧化蛋白产物)升高，脑脊液中总抗氧化能力降低，MALDI-TOF质谱分析，发现锌-α2-糖蛋白和铜蓝蛋白前体蛋白水平升高，转铁蛋白、α1-抗胰蛋白酶前体和β2微球蛋白3个蛋白水平下降，但其联合诊断作用尚不明确[13]。

1.4 泛素化蛋白相关标志物 反式激活效应DNA结合蛋白43(TDP-43)是ALS泛素化蛋白包涵体的主要成分，在脑脊液中呈高表达，具有较高特异性。ALS患者脑脊液中TDP-43水平显著增高，在疾病起始阶段可作为疾病早期标志物。研究提示脑脊液中TDP-43水平减低提示TDP-43在皮质和脊髓运动神经元内累积，可能与生存期短有关[4]。也有报道称TDP-43对评估靶向药物治疗效果具有重要作用[14]。

1.5 血脑屏障(blood brain barrier, BBB)/血脊髓屏障(blood-spinal cord barrier, BSCB)/血脑脊液屏障(blood-cerebrospinal fluid barrier, BCSFB)功能障碍相关标志物 (1)内皮细胞：内皮转运受损会影响BBB/BSCB/BCSFB完整性，进而引起中枢神经系统(CNS)实质内血管渗漏、微出血和含铁血黄素沉积等，最终导致ALS患者脊髓前角低灌注。ALS患者外周血中内皮细胞数量减少[15]，但这一检测技术应用性不高。(2)金属蛋白酶(MMPs)：是保持BBB/BSCB/BCSFB功能完整性的酶类，由内皮细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞等表达产生。MMPs通过降解层粘连蛋白、纤连蛋白和Ⅳ型胶原等实现CNS重塑，并刺激小胶质细胞分泌细胞因子和自由基以影响BBB/BSCB渗透性。多项研究证实ALS患者和动物模型中脑脊液、血清和CNS组织内MMP-2、MMP-9水平升高[4]。

1.6 神经递质相关标志物 (1)谷氨酸盐：ALS患者脑脊液中谷氨酸水平明显增高，其增高与病程和病情严重程度变化不一致，可能与检测技术复杂有关。脑脊液中谷氨酸盐浓度升高可见于约40%ALS患者[4]。(2)5-羟色胺及其代谢产物5-羟吲哚乙酸： 5-羟色胺在ALS尸检患者颈段和胸段脊髓中较正常对照无明显差别，在腰段脊髓内其含量略高于正常对照。5-羟吲哚乙酸在ALS尸检患者颈段和胸段脊髓中含量降低，腰段脊髓中其含量在正常范围内。脑脊液中是否存在此种改变尚未可知。

1.7 神经保护相关标志物 (1)色素上皮衍生因子(PEDF)：一种视网膜生长因子，可阻止谷氨酸盐诱导的神经元变性。ALS患者脑脊液中PEDF水平增高[16]。(2)血管内皮生长因子(VEGF)：病程较短ALS患者脑脊液中VEGF降低[17]；亦有报道ALS患者脑脊液中VEGF升高，并与较长病程和肢体起病有关[18]。(3)颗粒蛋白前体(PGRN)：一种神经营养生长因子，作为CNS损伤后小胶质细胞反应的标志物，具有提高神经元存活并促进轴突生长的作用[19]。ALS患者脑脊液和血浆中PGRN水平较对照无明显差别，随疾病进展其脑脊液和血浆含量递增[20]。(4)胱抑素C(Cys-C)：一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，兼具神经毒性和神经保护作用。ALS患者脑脊液中Cys-C水平较对照组明显减低，临床疾病进展缓慢或无进展可引起Cys-C水平增高，病情加重会引起其水平减低；进展缓慢患者脑脊液中Cys-C基线水平较低。亦有报道Cys-C水平较高者生存期较长[21]。

1.8 炎性反应和免疫激活相关标志物 (1)细胞因子/补体/抗体：脑脊液中IL-6、IL-8、C3、C4、过氧硝酸盐、前列腺素E2、新喋呤、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)以及细胞结构相关抗体水平升高[4]。此外，G-CSF和MCP-1在ALS患者血清中明显升高[13]。(2)抗神经元抗体：部分ALS患者脑脊液中抗GM1-神经节苷脂、去唾液酸-GM1-神经节苷脂和硫苷脂等抗神经元抗体阳性，提示自身免疫反应可能参与启动运动神经元变性过程。(3)壳三糖苷酶(CHIT-1)：由小胶质细胞或浸润性巨噬细胞合成的酶类。ALS患者脑脊液中CHIT-1显著高于其他神经系统疾病患者，CHIT-1高表达提示小胶质细胞激活的神经炎性反应[22]。(4)半乳糖凝集素-3：一种半乳糖结合蛋白，可与细胞内糖蛋白、细胞表面分子和细胞外基质相互作用。ALS尸检患者脊髓内半乳糖凝集素-3升高，脑脊液中半乳糖凝集素-3为对照组两倍之多[23]。

1.9 线粒体功能障碍标志物 (1)代谢物：通过核磁共振波谱技术对ALS患者脑脊液代谢物进行捕获分析，发现葡萄糖、乳酸、柠檬酸和乙醇水平升高，提示ALS患者可能处于高异化状态，提示线粒体功能障碍参与发病过程。内源性乙醇可作为反映ALS患者神经组织损伤的一项新的标志物[24]。

1.10 其他生物标志物 (1)同型半胱氨酸： ALS患者血浆和脑脊液中同型半胱氨酸较对照组明显升高，与疾病进展、起病年龄和起病部位无相关性，目前国内有类似报道，其临床应用价值有待商榷[25]。(2)丙烯醛：ALS患者脑脊液中丙烯醛增高，与病情严重程度明显相关，与疾病进展无关。神经系统炎性脱髓鞘患者也可见类似表现，故诊断特异性较低[4]。(3)金属元素：ALS患者脑脊液中铁、铜、锌、镁浓度显著高于对照组，且以镁升高最为显著[26]。(4)胰岛素样生长因子(IGF)及IGF结合蛋白：IGF结合蛋白1在ALS患者脑脊液和血清中下降。ALS患者脊髓前角细胞中, IGF-1水平降低，IGF结合蛋白-2表达增加，而脑脊液中未发现此变化。也有学者报道了与之相反的结果[27]。(5)microRNA：ALS患者脑脊液中microRNA181a-5p上调，microRNA21-5p和microRNA15b-5p下调。microRNA181a-5p/microRNA21-5p和microRNA181a-5p/microRNA15b-5p比值用于诊断ALS，其敏感度和特异度可分别达到90%，85%和87%，91%[28]。(6)碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)：ALS患者脑脊液和血清中FGF-2升高，与临床指标无相关性，其诊断价值可能有限[29]。(7)ALS患者脑脊液中细胞色素C、神经分泌蛋白生长因子和甲状腺素运载蛋白下调[30]。(8)Fms样络氨酸激酶受体3(Flt3)：ALS患者脑脊液和血液中Flt3显著升高，提示血脑屏障破坏，该物质弥散进入CNS增加[31]。(9)Vgf：一种神经生长因子诱导肽，是嗜铬粒蛋白家族的一员。ALS患者脑脊液中Vgf水平随肌力减弱而下降，有望成为反映肌力减退的可靠指标[27]。

2 血液学检查

(1)肌酐：通过对未行气管切开的ALS患者进行分析，发现血清肌酐基线水平低与生存期短具有相关性，血清肌酐水平与肌萎缩侧索硬化功能评分、用力肺活量和症状持续时间有显著相关性[4]。(2)肌酶：多数ALS患者血清肌酶明显升高，可作为预测ALS生存的有效指标，男性患者和肢体起病显示肌酶高水平，肌酶与肌肉痉挛有相关性，肌酶水平低预示生存期较长[32]。(3)嗜伊红衍化神经毒素：ALS患者血清嗜伊红衍化神经毒素明显高于正常对照[4]。(4)尿酸：ALS患者血清尿酸低于正常对照，男性患者更突出，但亦见于其他神经系统变性疾病，其临床意义有限[33]。(5)可溶性OX40：是血清肿瘤坏死因子受体之一，可溶性OX40显著低于对照组，提示细胞因子可能参与ALS发病[34]。(6)多聚糖： ALS患者血清起源N多聚糖中唾液酸多聚糖增高，核心岩藻糖化多糖减低。提示血清多聚糖可作为ALS疾病标志物，可能参与了神经元损害[35]。(7)内质网应激反应性分子伴侣：ALS患者血液中内质网应激反应性分子伴侣(PDIA1、ERp57等)水平上调，此改变亦见于SOD1基因突变小鼠单核细胞中。队列研究发现TDP-43、亲环蛋白A和ERp57与ALS患者病程显著相关，其中ERp57最为显著[36]。(8)脂质氢过氧化物(LPO)：ALS患者血清和脑脊液中LPO明显升高，疾病严重程度相似的吸烟患者较非吸烟患者LPO水平更高[37]。(9)炎性因子：ALS患者血浆中肌酸激酶、铁蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-8、IL-12p70、IL-4、IL-5、IL-10和IL-13升高，IFN-γ降低[38]。(10)转化生长因子β(TGF-β)：参与神经系统变性疾病过程，在神经系统生存和发育等方面具有重要作用。ALS患者血浆中TGF-β1升高，提示在ALS发病中充当多功能细胞因子的作用[39]。(11)载脂蛋白E(ApoE)：ALS患者血浆ApoE较对照组无差异，与疾病进展速率和生存时间相关，可作为一项预测生存的危险因素[40]。

基于目前国内外一系列研究探索，多数生物学标志物在动物模型和体外模型呈现较好的应用价值，但其尚不能满足实际临床需要；还有一部分标志物虽在人类体液中呈现明显的改变，并与某些临床指标相关，但其敏感性和特异性不高；极少数标志物在ALS患者中有较明显的改变趋势，并具有可观的临床应用价值，其中脑脊液NF水平呈现出较高的研究价值，并有望成为诊断疾病和提示预后的重要标志物；TDP-43蛋白在ALS患者脑脊液中呈高表达，具有较高特异性，对评估靶向药物疗效也有重要作用；脑脊液中Vgf有望成为反映肌力减退的可靠指标。此外，血清肌酐在评估临床疾病严重程度方面显示出高的价值；血清肌酶可作为预测ALS生存的有效指标，肌酶水平低预示生存期较长。综上所述，随着蛋白质组学和基因代谢产物等新技术的发展及应用，相信ALS生物学标志物的研究将不断深入和发展。

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(2016-12-20收稿 2017-01-15修回)

(责任编辑 武建虎)

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任雨婷，博士研究生，医师。

100853 北京，解放军总医院神经内科

黄旭升, E-mail：lewish301@sina.com

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