脐带间充质干细胞移植治疗脑瘫患儿流涎症疗效观察

彭亚伟，王晓东，徐成娥，代广辉，刘学彬，张 赞，安沂华，3



脐带间充质干细胞移植治疗脑瘫患儿流涎症疗效观察

彭亚伟1，王晓东1，徐成娥2，代广辉1，刘学彬1，张 赞1，安沂华1，3

目的 探讨应用脐带间充质干细胞移植治疗脑瘫患儿流涎症的疗效。方法 25例脑瘫合并流涎症患儿被随机分入实验组和对照组。实验组每位患儿接受4次腰椎穿刺干细胞移植术，对照组不给予任何手术及药物干预治疗，实验组于移植前及移植后1、3、6个月进行流涎频率及严重程度评分(SF)、唾液称重(W)、流涎商测定(DQ)。对照组于入组时及入组后1、3、6个月分别行SF、W、DQ评定。结果 实验组与对照组相比较，实验组SF、DQ在术后1、3、6个月均明显低于对照组(P<0.05)，差异具有统计学意义；SF指标显示术后1、3、6个月治愈率分别为61.54%、23.08%、23.08%；DQ指标显示术后1、3、6个月治愈率分别为69.23%、46.15%、23.08%；SF、DQ术后1、3、6个月有效率均为69.23%。W指标显示术后1、3个月，实验组明显低于对照组(P<0.05)，差异具有统计学意义，术后1、3个月实验组治愈率分别为69.23%、38.46%，有效率均为69.23%；术后6个月实验组与对照组差异不具有统计学意义，但实验组患儿个体比较，术后6个月与术前相比治愈率为23.08%，有效率为69.23%。结论 脐带间充质干细胞移植可以显著改善脑瘫患儿流涎症，从而提高患儿生活质量。

间充质干细胞；脑瘫；流涎；

脑性瘫痪(简称脑瘫)是指患儿从受孕到出生后1个月的发育时期内因非进行性脑损伤所致的综合征，主要表现为中枢性运动障碍及姿势异常[1]。脑瘫患儿中有10%～37%伴有不同程度的流涎症[2]。脑瘫患儿流涎症严重影响患儿个体卫生，增加患儿喂养难度，加重患儿家庭经济负担[3-5]。目前，脑瘫患儿流涎症治疗方法有外科手术、药物及肉毒素注射、针灸、神经电刺激、行为治疗等。这些治疗方法虽有一定疗效，但是其有效时间、有效程度仍不能令人满意[6]。因此，临床上迫切需要寻求新的治疗方法。本研究旨在观察脐带间充质干细胞治疗脑瘫患儿流涎症的疗效。

1 对象与方法

1.1 对象 2015-08至2016-02于武警总医院功能神经外科招募脑瘫合并流涎患儿25例。随机分为实验组和对照组，实验组13例，男8例，女5例，年龄5～12岁，平均(8.54±2.29)岁；对照组12例，男8例，女4例，年龄4～12岁，平均(7.08±2.27)岁，两组患儿年龄行独立样本均数t检验(P>0.05)，两组患儿年龄差异不具有统计学意义。实验组接受脐带间充质干细胞移植治疗，对照组不接受任何影响患儿唾液分泌的药物治疗、行为治疗及外科手术治疗。入选标准：(1)符合脑性瘫痪诊断标准并伴流涎症；(2)4岁≤年龄标准≤12岁；(3)各患儿在入组前6个月流涎稳定且未接受任何影响流涎的治疗；(4)告知患儿法定监护人脐带间充质干细胞移植治疗的方案及可能的疗效、不良反应后，签订知情同意书。排除标准：(1)病毒性脑炎、结核性脑炎、遗传代谢病所致的中枢性脑损伤等引起的运动障碍及正常小儿的一过性发育落后；(2)面颈部皮肤有创面；(3)伴有严重先天性疾病、唐氏综合症、癫痫发作频繁，合并严重水电解质紊乱、呼吸道感染、腹泻；(4)肝功能、肾功能异常；(5) 入组前6个月之内接受了其他流涎症治疗 。两组患儿均顺利完成随访。治疗方案根据中国人民武装警察部队后勤部卫生部《关于总医院申请临床应用神经干细胞移植治疗中枢神经系统损伤的批复》(卫医[2006]11 号) 执行，并已获得中国人民武装警察部队总医院医学伦理委员会批准(No.201209)，且在美国FDA注册，注册号(NCT01929434)。

1.2 方法

1.2.1 脐带间充质干细胞的分离与培养 脐带间充质干细胞提取方法与我课题组已报道的提取方式相同[7]：选择正常孕周计划行剖宫产手术的孕妇，术前签署知情同意书，术中留取一段长10 cm的脐带后，浸泡于无菌生理盐水中。超净台内取出脐带，75%乙醇消毒30 s，生理盐水充分洗涤，去除脐带外膜、脐静脉、脐动脉，留取脐带胶质，剪成大小约0.5 cm的3块组织，置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中进行培养，每3 d更换一次培养液。脐带间充质干细胞每5～7 d传代1次，选择第4代以后细胞，冷冻并储藏于液氮中用于移植。应用倒置相差显微镜和流式细胞仪进行鉴定：细胞在相差显微镜下生长旺盛并呈典型间充质干细胞表型；用流式细胞仪检测细胞表型，CD105、CD90、CD73、CD44的百分数均高于95%，而CD19、CD45、CD11b、CD34的百分数都不高于5%。

1.2.2 脐带间充质干细胞移植术前制备 术前解冻脐带间充质干细胞并继续培养3 d，制成浓度为1×107/ml细胞混悬液1 ml，备用。

1.2.3 脐带间充质干细胞移植方式 常规检查排除手术禁忌证后，局部麻醉下定位于L4～5椎间隙行腰椎穿刺术，确认穿刺针进入蛛网膜下腔后，将1 ml干细胞混悬液缓慢注入蛛网膜下腔。 每隔5～7 d移植1次，连续行4次腰椎穿刺干细胞移植术为1个疗程。

1.3 疗效评定 实验组于移植前及移植后1、3、6个月进行流涎频率及严重程度评分(SF)[8]、唾液称重(W)、流涎商测定(DQ)[9]。对照组于入组时及入组后1、3、6个月分别行SF、W、DQ评定。流涎频率评级：Ⅰ级，从不流涎；Ⅱ级，偶尔流涎，不是每天；Ⅲ级，频繁流涎，每天都有部分时间；Ⅳ级，不断流涎。流涎严重程度评级标准：Ⅰ级，从不流涎，嘴唇是干的；Ⅱ级，轻微流涎，仅仅引起嘴唇湿润；Ⅲ级，中度流涎，引起嘴唇和下巴湿润；Ⅳ级，严重流涎，达到脖颈，引起衣服潮湿；Ⅴ级，过多流涎，将衣服、双手、周围物品弄湿。Ⅰ～Ⅴ级分别计分1～5分，SF为流涎频率分数与严重程度分数之和。唾液称重(W)：将牙科围兜固定于患儿衣服上30 min，采集患儿嘴角流出的唾液，唾液采集前后围兜的重量差即该患儿本次流涎重量，单位精确到0.0001 g。流涎商(DQ)指在一定时间内观察到的流涎次数除以总观察次数所得的商，用来评估流涎严重程度。本研究采用10 min流涎商，即10 min 内的40 个15 s，每个15 s唇边如有新生成的唾液流出，则计流涎1次。流涎商为流涎次数除以40 再乘以100，评分为0～100。疗效评定标准为：痊愈，流涎完全消失；显效，流涎基本消失；有效，流涎明显减少；无效，流涎无减少或加重[10]。W、DQ减少基线值的50%以上为流涎治疗有效[11]。所有的评定由同一名有资质的康复师完成。每位患儿均在相同的房间、相同的位置进行流涎评估，评估前1 h禁饮食。为避免其他因素干扰神经功能评定，要求两组患儿在6个月内均不得服用影响唾液分泌的药物或其他治疗。

2 结 果

2.1 两组患儿唾液称重(W) 实验组和对照组两组患儿在入组时唾液称重差异不具有统计学意义[(2.0132±1.0803)vs(1.8996±1.3308)，P>0.05]，说明两组患儿入组后唾液称重具有可比性。术后1个月实验组和对照组唾液称重差异具有统计学意义[(0.7232±1.2137)vs(1.8981±1.0912)，P<0.05]，其中实验组有9例唾液称重减少为100%，其余4例均小于50%，即实验组治愈率和有效率均为69.23%。术后3个月实验组和对照组唾液称重差异具有统计学意义[(0.8099±1.2334)vs(1.9504±1.0823)，P<0.05]，其中实验组有5例唾液称重减少100%，4例大于50%，4例小于50%，即实验组治愈率为38.46%，有效率69.23%。术后6个月实验组和对照组唾液称重差异不具有统计学意义[(1.0653±1.3939)vs(1.9143±1.1530)，P>0.05]，其中实验组有3例唾液称重减少100%，6例大于50%，4例小于50%。

2.2 两组患儿流涎频率及严重程度评分(SF) 实验组和对照组两组患儿在入组时流涎频率及严重程度差异不具有统计学意义[(6.9231±0.9541)vs(6.5833±0.9962)，P>0.05]，说明两组患儿入组后流涎频率及严重程度具有可比性。术后1个月实验组和对照组流涎频率及严重程度评分差异具有统计学意义[(3.5385±2.2955)vs(6.7500±0.6216)，P<0.01]，其中实验组有8例SF评分为2，1例为3，4例无明显变化，即术后1个月有8例完全不流涎(8/13)，1例偶尔流涎(1/13)，实验组术后1个月治愈率61.54%，有效率69.23%。术后3个月实验组和对照组流涎频率及严重程度评分差异具有统计学意义[(4.3077±2.1750)vs(6.6667±0.6513)，P<0.01]，其中实验组有3例SF评分为2，3例评分为3，3例评分为4，4例无明显变化，即术后3个月3例完全不流，6例偶尔流涎，即实验组术后3月治愈率为23.08%，有效率为69.23%。术后6个月实验组和对照组流涎频率及严重程度评分差异具有统计学意义[(4.2308±2.0878)vs(6.6667±0.6513)，P<0.01]，其中实验组有3例SF评分为2,3例评分为3,3例评分为4，4例无明显变化，即术后6个月3例完全不流，6例偶尔流涎，即实验组术后6个月治愈率为23.08%，有效率为69.23%。

2.3 两组患儿流涎商测定(DQ) 实验组和对照组两组患儿在入组时流涎商(DQ)测定差异不具有统计学意义[(21.38±6.63)vs(19.08±6.92)，P>0.05]，说明两组患儿入组后流涎商具有可比性。术后1个月实验组和对照组流涎商(DQ)测定差异具有统计学意义[(7.92±12.45)vs(18.83±4.86)，P<0.01]，其中实验组有9例流涎商(DQ)减少为100%，4例小于50%，实验组术后1个月治愈率和有效率均为69.23%。术后3个月实验组和对照组流涎商(DQ)测定差异具有统计学意义[(8.69±11.80)vs(19.42±5.43)，P<0.01]，其中实验组有6例流涎商(DQ)减少为100%，3例减少大于50%，4例小于50%，实验组治愈率46.15%，有效率69.23%。术后6个月实验组和对照组流涎商(DQ)测定差异具有统计学意义[(10.38±11.85)vs(20.00±5.33)，P<0.05]，其中实验组有3例流涎商(DQ)减少为100%，6例减少大于50%，4例小于50%，即术后6个月实验组治愈率为23.08%，有效率为69.23%。

2.4 实验组患儿术中及术后不良反应 不良反应：实验组有2例患儿术后48 h 内出现低颅压反应，表现为轻度头晕头痛，偶伴恶心、呕吐，呕吐呈非喷射性。上述症状下床活动后加重，平卧时症状缓解或消失。嘱这些患儿采取去枕平卧位 、静脉点滴生理盐水后症状缓解和消失。

3 讨 论

流涎是在无意识状态下涎液自口腔流出，正常婴幼儿在3岁时，口腔运动肌肉基本成熟，在此之前可出现一过性生理性流涎。4岁以后，清醒状态下出现流涎则为异常流涎[12-15]。涎液是在自主神经系统调控下由腮腺、下颌下腺和舌下腺分泌，有消化、免疫及清洁口腔等作用[16]。味觉、嗅觉及口腔咀嚼运动可刺激涎腺分泌涎液。正常情况下，唾液可随吞咽运动被清除。吞咽运动分为口期、咽期和食管期。脑瘫是儿童流涎的主要原因[17]。有文献报道X线检查提示脑瘫患儿吞咽运动的咽期和食管期与正常儿童无明显差异。Erasmus等[12]和Senner等[18]分别报道伴流涎症脑瘫患儿不存在涎液的高分泌，口期的吞咽运动障碍可能是脑瘫患儿流涎症的机制之一。其他可能的机制尚不完全清楚。

目前，流涎症有多种治疗方法，但均不能令人满意。外科手术主要通过腺体切除、导管结扎、导管改道及离断副交感神经等，减少涎液分泌或改变涎液流出方向，达到治疗目的，其远期有效率可达80%以上，但需承担一定手术风险，且可能伴有口腔干燥等并发症[19]。东莨菪碱、苯扎托品和格隆溴铵等抗胆碱能药物治疗流涎症不良反应不能忍受[20,21]。2001年以来，腮腺及下颌下腺内注射肉毒素治疗流涎症备受关注，但不同医师的注射技术参差不齐，注射剂量与流涎严重程度的量效关系也尚未形成统一标准[22]。Basciani 等[23]对17 例脑瘫患儿注射B 型肉毒毒素1500 mU、3000 mU、5000 mU，结果显示低剂量无效，中剂量症状明显改善，高剂量疗效无增加但口腔干燥、吞咽困难等不良反应增加。儿童行肉毒毒素注射需在全麻下进行，每6～12个月注射1次[24]。肉毒毒素注射不良反应发生率为 2%～41%，最严重的不良反应为吞咽困难和吸入性肺炎。儿童行肉毒素治疗的安全性和有效性有待进一步研究[25]。

本研究采用脐带间充质干细胞对25例脑瘫合并流涎症患儿进行移植治疗，手术方式为腰椎穿刺手术。两组患儿术前指标差异不具有统计学意义，提示两组具有可比性。研究结果显示，实验组与对照组相比较，实验组流涎频率及严重程度评分(SF)、流涎商(DQ)在术后1、3、6个月均明显低于对照组(P<0.05)，差异具有统计学意义，说明脐带间充质干细胞移植治疗脑瘫患儿流涎症是有效的，术后1、3、6个月有效率均为69.23%。SF指标显示术后3个月与术后1个月相比较，部分患儿的SF有所反弹，表现为完全治愈的患儿比例降低，从8名患儿降低为3名，但实验组有效率不变，仍然为69.23%，术后6个月与术后3个月相比SF内部构成无进一步改变，术后1、3、6个月治愈率分别为61.54%、23.08%、23.08%。DQ指标显示术后3个月实验组流涎商较术后1个月有所增加，术后6个月较术后3个月又有所增加，主要表现为完全治愈的患儿数量从术后1个月时的9例，减少到术后3个月时的6例和术后6个月时的3例，术后1、3、6个月治愈率分别为69.23%、46.15%、23.08%。W指标显示术后1、3个月，实验组明显低于对照组，(P<0.05)，差异具有统计学意义，术后1、3个月实验组治愈率分别为69.23%、38.46%，术后1、3个月有效率均为69.23%；术后6个月实验组与对照组的组间差异不具有统计学意义，但按照唾液称重指标减少50%以上为有效来衡量，实验组患儿的有效率仍为69.23%。综上所述，脐带间充质干细胞移植治疗脑瘫患儿流涎症是有效的，但远期疗效有待进一步研究。

已有多篇文献报道，间充质干细胞对于脑瘫患儿运动功能的恢复有很好的疗效[26-28]， 而吞咽功能障碍可能是脑瘫患儿流涎症的机制之一，因此，推测本研究中，干细胞治疗通过改善患儿的吞咽功能，达到改善脑瘫患儿流涎的症状。

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(2016-12-13收稿 2017-02-21修回)

(责任编辑 梁秋野)

Transplantation of umbilical cord mesenchymal stem cells effectively improves drooling of cerebral palsy patients

PENG Yawei1, WANG Xiaodong1,XU Chenge2,DAI Guanghui1,LIU Xuebin1,ZHANG Zan1, and AN Yihua1，3.

1.Department of Functional Neurosurgery, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100039,China; 2.Department of Children Rehabilitation Center, Maternal and Children Health-care Hospital, Zibo 255000, China; 3.Laboratory of Stem Cells, Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, Beijing 100093,China

Objective To observe the clinical effect of umbilical cord mesenchymal stem cells transplantation on drooling of cerebral palsy patients.Methods Twenty-five cases of cerebral palsy children with drooling were randomly assigned into the experimental group and control group. Each child in the experimental group accepted four times of stem cells transplantation via lumbar puncture, while patients in the control group were given neither surgery nor drug intervention. The frequency and severity (FS) of drooling,saliva weight (W),and drooling quotient (DQ)in both groups were assessed one, three and six months before and after transplantation respectively.Results SF and DQ of the experimental group one, three and six months after transplantation were significantly lower than in the control group (P<0.05), and the difference was statistically significant. SF indicated that one, three and six months after transplantation the cure rate was 61.54%, 23.08% and 23.08% respectively. DQ suggested that the cure rate was 69.23%, 46.15% and 23.08% respectively. SF and DQ showed that the efficacy rate one, three and six months after transplantation was 69.23%. One and three months postoperatively, the value of W was significantly lower than that of the control group (P<0.05). One and three months after transplantation, the cure rates were 69.23% and 38.46% respectively in the experimental group.Six months after transplantation, there was no statistically significant difference between the experimental group and control group. However, the cure rate of the experimental group six months postoperatively was 23.08%, and the efficacy rate was 69.23%.Conclusions The umbilical cord mesenchymal stem cells transplantation can significantly improve the drooling in children with cerebral palsy, thus improving the life quality of patients.

umbilical cord mesenchymal stem cells; cerebral palsy; drooling

广东省战略性新兴产业核心技术攻关项目(2011A081401003)

彭亚伟，硕士在读。

1.100039 北京，武警总医院功能神经外科； 2.255000 淄博，山东省淄博市妇幼保健院儿童康复中心；3.100093，首都医科大学北京三博脑科医院干细胞室

安沂华，E-mail:riveran@163.com

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