比格犬胃底黏膜相关生物活性因子的增龄变化*

李小雯 郑松柏 张晓莉 刘 菲

复旦大学附属华东医院消化科(200040)

比格犬胃底黏膜相关生物活性因子的增龄变化*

李小雯 郑松柏#张晓莉 刘 菲

复旦大学附属华东医院消化科(200040)

背景：近年研究证实胃黏膜随增龄更易受侵袭因素的损害，既往胃黏膜老化研究多以胃窦黏膜为主，鲜有提及胃底黏膜。目的：研究比格犬胃底黏膜相关生物活性因子的增龄变化。方法：将19只健康比格犬分为中青年组(1～5岁)、低龄老年组(6～8岁)和高龄老年组(≥9岁)，以TBA法测定胃底黏膜组织中MDA、LPO、MPO含量，ELISA法测定胃底黏膜组织中PTEN、TE、survivin、caspase-3、caspase-9、ZO-1、CGRP、VEGF、COX-1和COX-2含量。结果：与中青年组和低龄老年组相比，高龄老年组胃底黏膜MDA、LPO、MPO、PTEN、TE、ZO-1、CGRP、VEGF、COX-1和COX-2含量显著升高(P<0.05)，caspase-3和caspase-9含量无明显差异(P>0.05)。低龄老年组和高龄老年组胃底黏膜中survivin含量显著低于中青年组(P=0.000)。结论：老年比格犬胃底黏膜相关生物活性因子含量存在不同程度的不利变化，但高龄老年组与调节黏膜下血流、黏膜再生和上皮间紧密连接等相关的生物活性因子反而升高，可能是一种“退化-代偿”现象。

胃底； 衰老； 降钙素基因相关肽； 环氧合酶1； 环氧合酶2

临床和实验研究表明，胃黏膜结构和功能随增龄出现异常，黏膜下血流(GMBF)减少、缺氧以及调节黏膜上皮凋亡的生物活性因子发生不利改变，导致胃黏膜更易受侵袭性因素的损害[1]。既往胃黏膜老化研究多以胃窦黏膜为研究对象，鲜有涉及胃底黏膜。此外，人在衰老过程中不可避免地受乙醇、药物，尤其是幽门螺杆菌(Hp)感染等环境因素的影响。本研究以无Hp感染的国际标准实验动物比格犬为研究对象，通过研究胃底黏膜相关生物活性因子的增龄改变，旨在探讨胃底黏膜防御-修复机制随增龄的变化。

材料与方法

一、实验动物

19只国际标准实验用比格犬于2003年起陆续饲养于中国科学院上海药物研究所，犬龄1.33～10.58岁，每个月血常规、血生化、心电图、脑电图等检查均在正常范围内。根据网站http://www.maxiebeagle.com/dogage.htm，将比格犬年龄换算成人类年龄，并分为中青年组(1～5岁，n=8)、低龄老年组(6～8岁，n=5)和高龄老年组(≥9岁，n=6)。

二、研究方法

1. 获取标本：取标本前1天晚上8：00后禁食、禁水，次日上午9：00开始静脉麻醉，剖腹，游离胃，沿胃大弯切开胃腔，距贲门6～8 cm处取胃底组织2块(深达黏膜下层)，大小约1.0 cm×0.2 cm×0.2 cm，置于液氮-80 ℃保存。

2. TBA法：准确称取组织重量，制备匀浆，离心，取上清液200 μL，根据检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书，测定丙二醛(MDA)、脂质过氧化物(LPO)、髓过氧化物酶(MPO)含量。

3. ELISA法：准确称取组织重量，制备匀浆，离心，取上清液40 μL，参照ELISA测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书，测定比格犬胃底黏膜组织中磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)、端粒酶(TE)、生存素(survivin)、caspase-3、caspase-9、紧密连接蛋白ZO-1、降钙素基因相关肽(CGRP)、血管内皮生长因子(VEGF)、环氧合酶(COX)-1和COX-2含量。

三、统计学分析

结 果

一、胃底黏膜MDA、LPO、MPO含量

三组MDA、LPO、MPO含量相比差异有统计学意义(F=7.090，P=0.006；F=3.689，P=0.048；F=6.114，P=0.011)；进一步比较发现，高龄老年组MDA、LPO、MPO含量显著高于中青年组和低龄老年组(P<0.05)(表1)。

二、胃底黏膜PTEN、TE、survivin、caspase-3、caspase-9、ZO-1含量

三组PTEN、TE、survivin、ZO-1含量相比差异有统计学意义(F=4.777，P=0.024；F=5.147，P=0.019；F=15.437，P=0.000；F=5.365，P=0.016)；进一步比较发现，高龄老年组PTEN、TE、ZO-1含量显著高于低龄老年组(P<0.05)，但与中青年组相比无明显差异，低龄老年组和高龄老年组survivin含量显著低于中青年组(P<0.05)。而三组caspase-3、caspase-9含量差异无统计学意义(F=3.065，P=0.750；F=1.123，P=0.349)(表2)。

三、胃底黏膜CGRP、VEGF、COX-1、COX-2含量

三组CGRP、VEGF、COX-1、COX-2含量相比差异有统计学意义(F=5.418，P=0.016；F=5.364，P=0.016；F=7.336，P=0.005；F=5.158，P=0.019)；进一步比较发现，高龄老年组CGRP和COX-1含量显著高于中青年组和低龄老年组(P<0.05)，高龄老年组VEGF和COX-2显著高于低龄老年组(P<0.05)，与中青年组无明显差异(表1)。

讨 论

胃底黏膜的第一层屏障是黏液-碳酸氢盐-磷脂屏障，磷脂双分子层的脂肪酸链面向胃腔，形成一道疏水性屏障，保护胃黏膜上皮细胞免受胃酸和胃蛋白酶等的损伤。MDA、LPO、MPO是与胃黏膜氧化应激损伤和磷脂双分子层脂质过氧化有关的生物化学因子。本研究发现高龄老年组胃底黏膜MDA、LPO、MPO含量明显高于低龄老年组和中青年组(P<0.05)，提示增龄可能增加胃黏膜脂质过氧化，这可能与胃黏膜磷脂的疏水性随增龄降低有关[2]。

胃底黏膜的第二层屏障是胃黏膜上皮与上皮细胞间的紧密连接。PTEN具有调节细胞增殖、生长、迁移、分化等多种效应[3-5]；TE可延长染色体上的端粒，从而增强细胞增殖能力，与衰老关系密切[6]。本研究发现，高龄老年组PTEN和TE显著高于中青年组和低龄老年组(P<0.05)；低龄老年组和高龄老年组抗凋亡蛋白survivin含量显著低于中青年组(P<0.05)。凋亡相关因子caspase-3和caspase-9分别参与细胞凋亡的执行和起始，可间接反映细胞凋亡状况。本研究发现两者含量在三组中的差异无统计学意义。紧密连接是维持黏膜上皮机械屏障和通透性的重要结构，ZO-1是重要的组成蛋白之一。有研究表明老年大鼠上皮组织中ZO-1含量明显低于幼年大鼠，从而导致上皮屏障功能下降[7-8]。本研究显示高龄老年组胃底黏膜ZO-1含量显著高于中青年组和低龄老年组(P<0.05)。

表1 各组胃底黏膜MDA、LPO、MPO、CGRP、VEGF、COX-1和COX-2含量

表2 各组胃底黏膜PTEN、TE、survivin、caspase-3、caspase-9、ZO-1含量

胃黏膜的第三层屏障是GMBF，其减少是胃黏膜损伤发生的中心环节，临床研究发现单纯GMBF降低即可引起胃溃疡的发生，而增加GMBF可促进溃疡愈合[9]。李雅君等[10]报道老年人贲门、胃体、胃角血流均显著低于中青年人。机体内多种生物活性因子参与调控GMBF。VEGF与黏膜细胞增殖、再生和GMBF密切相关[11-12]；CGRP是重要的血管扩张神经肽，多项研究显示老年大鼠胃黏膜防御功能降低与黏膜下血管周围神经纤维分泌的CGRP减少有关[13-14]；环氧合酶是花生四烯酸合成前列腺素(PGs)的限速酶，PGs可增加GMBF并通过增加VEGF表达起黏膜保护的作用[15]。本研究显示，低龄老年组胃底黏膜CGRP、VEGF、COX-1和COX-2含量显著低于中青年组，而高龄老年组显著高于中青年组和低龄老年组。

总之，本研究发现，与细胞增殖、上皮间紧密连接、黏膜修复和GMBF相关的PTEN、TE、ZO-1、CGRP、VEGF、COX-1和COX-2在低龄老年组明显降低，而高龄老年组明显升高。这种现象未见相关文献报道，我们暂且称之为老化过程中的“退化-代偿(degeneration-compensation)”现象，这种现象有利于老化过程中胃底黏膜内重要功能腺体-胃底腺形态和功能的保护，再次验证了本课题组的相关研究[16-18]结果；这种现象有利于维持老年人胃底黏膜的完整性，可能是胃底糜烂、溃疡等病变较胃窦少见的原因之一。但发生这种“退化-代偿”现象的内在机制尚不清楚，有待进一步研究。

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(2016-07-11收稿；2016-09-05修回)

Effect of Aging on Related Biological Activity Factors in Gastric Fundic Mucosa in Beagle Dogs

LIXiaowen,ZHENGSongbai,ZHANGXiaoli,LIUFei.

DepartmentofGastroenterology,HuadongHospital,FudanUniversity,Shanghai(200040)

ZHENG Songbai, Email: songbai1009@163.com

Gastric Fundus; Aging; Calcitonin Gene-Related Peptide; Cyclooxygenase 1; Cyclooxygenase 2

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.02.010

上海市科委科研计划项目(12ZR1409600)

#本文通信作者，Email: songbai1009@163.com

Background: Recent studies showed that gastric mucosa was more susceptible to injury by invasion factors with aging, however, the studies were mainly on gastric antral mucosa,fundic mucosa was rarely studied. Aims: To investigate the effect of aging on related biological activity factors in gastric fundic mucosa in beagle dogs. Methods: Nineteen beagle dogs were assigned into younger group (aged 1-5 years), junior elderly group (aged 6-8 years) and senior elderly group (aged≥9 years). The contents of MDA, LPO, MPO in gastric fundic mucosa were determined by TBA method. The contents of PTEN, TE, survivin, caspase-3, caspase-9, ZO-1, CGRP, VEGF, COX-1 and COX-2 were assessed by ELISA. Results: Compared with younger group and junior elderly group, contents of MDA, LPO, MPO, PTEN, TE, ZO-1, CGRP, VEGF, COX-1 and COX-2 were significantly increased in senior elderly group (P<0.05), no significant differences in contents of caspase-3 and caspase-9 were found among the three groups (P>0.05). The content of survivin in junior elderly group and senior elderly group was significantly decreased when compared with younger group (P=0.000). Conclusions: Disadvantaging changes of biological activity factors are found in gastric fundic mucosa in elderly beagles dogs, however, gastric mucosal blood flow, mucosa regeneration and epithelial tight junction related biological activity factors are significantly increased in senior elderly beagle dogs, which may be a phenomenon of degeneration-compensation.