不同时间下超低温保存肝癌组织细胞RNA完整性的差异分析

曹国强张峰陈雷鸣陈海李彪冯晓文李红春谢海洋周琳

·论著·

不同时间下超低温保存肝癌组织细胞RNA完整性的差异分析

曹国强1张峰1陈雷鸣1陈海1李彪1冯晓文1李红春2谢海洋1周琳1

目的 研究肝癌组织细胞样本于-80℃超低温保存条件下的质量控制，探讨肝癌组织细胞样本在超低温保存中的时效性。方法 随机抽取超低温新鲜冻存（24 h内）、保存3个月、6个月和1年不同时长的肝癌和对应的癌旁组织细胞各12对，HE染色评估标本取材的准确性，采用Promega自动提取核酸仪提取肝脏细胞RNA，利用Agilent 2100生物分析仪进行RIN值及28S/18S比值分析。对新鲜冻存、保存3个月、6个月以及1年的组织细胞样本的RIN值和28S/18S比值进行组间非配对t检验。结果 HE染色镜下观察发现切片组织细胞中肿瘤细胞比例达到80﹪以上，为生物样本库的合格样本。生物分析仪检测结果显示超低温新鲜冻存、保存3个月、6个月和1年的癌和癌旁组织细胞的RIN均值均>7.0，平均28S/18S比值均>1.5，组间非配对t检验显示，保存1年的肝癌组织细胞相比于新鲜冻存（7.442±0.674 vs 8.617±0.769，P = 0.001）、保存3个月（7.442±0.674 vs 8.275±0.617，P = 0.005）和6个月（7.442±0.674 vs 8.175±0.970，P = 0.043）的组织细胞RIN值显著下降，提示存在一定程度的RNA降解，而其余各组之间差异均无统计学意义（P均> 0.05）。 结论 在超低温条件下新鲜冻存、保存3个月、6个月的肝癌及癌旁组织细胞，其质量均可以获得有效保证，而保存1年的肝癌组织细胞的RNA虽然存在一定程度的降解，但能够满足后续临床科研的要求。

肝肿瘤； 组织细胞； RNA； 低温保存

生物样本库又称生物银行（Biobank），主要是指标准化收集、处理、储存和应用健康或疾病生物体的生物大分子、细胞、组织和器官等样本，包括人体器官组织、全血、血浆、血清、生物体液或经处理过的生物样本（DNA、RNA和蛋白等）以及与这些生物样本相关的知情同意、临床、治疗、随访和病理等资料及其质量控制、信息管理与应用系统。随着功能基因组学和生物芯片技术研究的深入，众多的肿瘤相关基因和蛋白被发现，其中一部分有望成为肿瘤预测、早期诊断个性化治疗和预后评估等重要的分子靶标或治疗的药物靶点。对新发现的基因或蛋白，需在人体肿瘤细胞中确认其表达水平和生物学功能及意义，因此生物样本库的建设成为转化医学研究领域中非常重要的组成部分[1]。根据美国病理学家协会发布的《生物样本库认证项目检视清单》和ISBER（国际生物和环境样本库协会）颁布的《2012生物样本库最佳实践规范》，在样本的采集、分装、入库、出库及检测过程中存在很多质控点，并利用各种技术分析之后获得的样本数据对样本的质量进行评估。然而，这些实践的方法学验证工作仍然是一片空白[2]。原发性肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常见的恶性肿瘤。由于起病隐匿，早期没有症状或症状不明显且进展迅速，因此确诊时大多数为中晚期，如果仅采取支持对症治疗，平均存活时间很短，严重地威胁人民群众的身体健康和生命安全[3]。因此在我国HCC的治疗和诊断研究具有重要的社会经济学意义，而建立HCC组织生物样本库，可以为研究HCC的科研人员节省大量的时间。样本的质控是保证样本的质量及后续科学研究顺利进行的关键，近年来我国生物样本库的数量越来越多，生物样本的质量控制显得尤为重要，包括样本采集、分装、入库、出库及检测整个过程中对样本的质量进行监控，避免样本出现污、降解染等质量问题。浙江大学医学院附属第一医院自建立肝胆胰疾病生物样本以来，收集了大量的临床样本，本文将重点探讨本院在HCC组织细胞样本质量控制方面的经验和面临的问题。

资料与方法

一、临床样本资料

采用简单随机抽样法抽取本院HCC手术患者超低温新鲜冻存（24 h内）、保存3个月、6个月和1年不同时长的HCC和对应癌旁组织各12对。用于超低温保存的样本应在组织离体后30 min内快速完成采集并立即放入液氮冻存，转入-80℃超低温冰箱存放。用于石蜡包埋的样本应立即用10﹪的福尔马林固定后送检。术后病理诊断均为HCC。

二、主要仪器及试剂

-80℃超低温冰箱（德国艾本德NBS U570），自动核酸提取仪（美国普洛麦格公司Maxwell 16），生物分析仪（美国安捷伦公司Agilent 2100）和光学显微镜（日本奥林巴斯BX41）。苏木素染液（北京中杉金桥生物技术有限公司ZLI-9610），水溶性伊红（北京中杉金桥生物技术有限公司ZLI-9613），总RNA提取试剂盒（美国普洛麦格公司AS1050）和RNA分析试剂盒（美国安捷伦公司5067-1511）。

三、质控方法

1.石蜡组织HE染色：随机抽取超低温冰箱新鲜冻存、保存3个月、6个月以及1年的HCC和癌旁组织及对应的石蜡组织，石蜡组织经3～5 μm厚度切片后，进行HE染色后镜下观察，如肿瘤细胞占总细胞的80﹪以上，则为生物样本库的合格样本。

2. RNA质量鉴定：随机抽取超低温冰箱新鲜冻存、保存3个月、6个月以及1年未经反复冻融的HCC组织及对应的癌旁组织各12对，通过总RNA提取试剂盒提取HCC组织细胞和相对应癌旁组织细胞的RNA，用Nano2000超微量分光光度计检测RNA浓度后，再用Agilent 2100 生物分析仪进行RNA 分子完整数值（RNA integrity number，RIN值）以及28S/18S比值的测定。结果判断：RIN值（0 ~10）直接反应了RNA质量的好坏，此数值越大表明RNA质量越好越完整，>7为高质量[4]。28S/18S比值即为衡量提取的RNA完整性的指标。28S条带的光密度为18S光密度的1.5～2.0倍，说明RNA未明显降解[5]。

四、统计学分析方法

采用SPSS 21进行统计分析，对新鲜冻存、保存3个月、6个月以及1年的组织细胞样本的RIN值和28S/18S值以±s表示，RIN值和28S/18S比值进行组间非配对t检验，多组间数据用单因素方差分析，以P < 0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、HE染色

随机抽取超低温冰箱新鲜冻存、保存3个月、6个月以及1年的HCC和癌旁组织及对应的石蜡组织48对，经切片后行HE染色。阅片结果显示所有受检组织细胞均细胞形态良好，染色清晰（图1）。HCC组织细胞片中，肿瘤细胞比例均超过80﹪，坏死组织细胞比例均< 10﹪，达到ICGC标准（坏死组织细胞比例< 20﹪），均为合格样本[5]。

图1 光学显微镜下观察肝癌组织及癌旁组织细胞形态（HE染色，×200）

表112 对不同保存时间点肝癌与癌旁组织细胞样本的RIN值比较（± s）

表112 对不同保存时间点肝癌与癌旁组织细胞样本的RIN值比较（± s）

注：与12个月的肝癌组织细胞比较，aP < 0.05

分组 0个月 3个月 6个月 12个月 F值 P值癌8.617±0.769a 8.275±0.617a 8.175±0.970a 7.442±0.674 4.964 0.005癌旁 7.742±0.464 7.825±0.956 7.533±0.768 7.550±0.815 0.416 0.742

表212 对不同保存时间点肝癌与癌旁组织细胞样本的28S/18S比值比较（± s）

表212 对不同保存时间点肝癌与癌旁组织细胞样本的28S/18S比值比较（± s）

分组 0个月 3个月 6个月 12个月 F值 P值癌1.625±0.398 1.558±0.219 1.608±0.309 1.508±0.223 0.379 0.769癌旁 1.525±0.314 1.517±0.335 1.575±0.540 1.542±0.312 0.053 0.984

二、RNA质量鉴定

不同保存时间点，HCC与癌旁组织细胞样本的RIN值及28S/18S比值见表1，2。新鲜冻存HCC组织细胞样本及保存3个月、6个月、12个月的RIN均值均>7.0，说明样本的RNA完整性较好。新鲜冻存的HCC组织细胞比癌旁组织细胞的RIN均值要高，但保存12个月的HCC组织细胞与癌旁组织细胞的RIN均值相近，在相同环境下HCC组织细胞要比癌旁组织细胞RNA的质量下降得快。采用非配对t检验，保存12个月与0个月的HCC组织细胞的比较结果，P = 0.001；保存12个月与3个月的HCC组织细胞的比较结果，P = 0.005；保存12个月与6个月的肝癌组织细胞的比较结果，P = 0.043。HCC与癌旁组织细胞样本新鲜冻存及保存3个月、6个月、12个月28S/18S比值结果显示均差异无统计学意义。其中HCC组织细胞RIN值采用多组间单因素方差分析，P = 0.005。图2所示样本1-8的28S和18S条带显示完好。样本3出现小片段的杂带，说明有小片段的RNA降解。图3a对应图2中样本1的峰图，其中28S峰值区域约为18S峰值区域的1.9倍，且杂带较少，说明组织细胞RNA较完好。图3b对应图2中样本3的峰图。其中28S峰值面积约为18S峰值面积的1.2倍，且18S和28S中间出现了一个峰值，说明组织细胞RNA有小片段降解。

图2 Agilent 2100 生物分析仪模拟电泳图

图3 RNA分析

讨 论

鉴于不同来源细胞中RNA酶含量差异较大，尤其是胰腺和小肠细胞中RNA酶含量丰富，极易造成RNA降解[6]。本研究对不同保存时长HCC及癌旁组织细胞的RNA降解情况进行了初步探索，发现新鲜HCC组织细胞比癌旁组织细胞的RIN均值要高，也就是说相同时间段内，相比于癌组织细胞，癌旁组织细胞中的RNA更容易发生降解，其原因有：（1）HCC组织细胞中RNA酶表达量减少，这种表达量降低与HCC的发生发展有关；（2）HCC组织细胞中存在RNA酶抑制剂高于相应的癌旁组织；（3）取样过程中冷缺血时间癌组织细胞中RNA酶的影响更大[7]。随着时间的推移，在超低温冰箱的保存下，保存1年的HCC组织细胞RIN均值明显下降，其程度高于对应癌旁组织。后续的工作中，笔者将加大样本量的验证，并对保存时间更久的HCC组织细胞样本质量进行测定。

国外的研究表明，在理想情况，样本保存的时间或温度不会显著影响RNA的完整性，但在实际操作过程中，保存时间越长，机械设备故障所导致的样本意外冻融概率也越高，并降低RNA的RIN值[8]。所以随着保存时间的延长，HCC组织细胞的RNA质量会有所降低。因此生物样本库要保持一定的“动态平衡”，也就是说在一定的时间内保证样本质量的前提下要能够及时地利用HCC样本，尽最大的可能利用HCC样本，促进生物样本库持续有效地科学发展。另外新鲜采集的HCC组织细胞样本及时地保存到超低温冰箱的同时也要淘汰一些保存时间较久质控结果不合格的样本。

由于组织细胞内的RNA容易降解，因此组织细胞RNA的完整性和均一性是评价样本质量的重要指标。迅速有效地采集、分装HCC组织和保存入库，以及后期冷链系统对超低温冰箱24 h的温度监测是减少RNA降解的关键因素。样本在出库及检测的过程中，应尽量避免DNA、RNA和蛋白质的降解，避免组织细胞的反复冻融，反复冻融可使细胞破碎，同时尽量保持在较低温度条件下操作[9]。

通过多年的样本库建设和结合临床的应用，笔者总结了一些经验和做法：（1）标本采集应由专人负责，而非采用临时人员轮流取样的方式；（2）基于ISBER颁布的《2012生物样本库最佳实践规范》，修改并完善了《样本库质量管理体系文件》和《样本库作业指导书》；（3）与软件公司合作，根据自身需求开发了一套生物样本库管理软件，与医院HIS系统实现对接，并结合了临床病历信息，更方便临床科研服务；（4）在临床样本取材过程中，一定要避免出血和坏死，采集到保存的整个过程一定要在标本离体30 min内完成操作；（5）在组织细胞RNA提取过程中，充分利用液氮使组织细胞完全破碎，提高RNA得率；（6）采用冷链系统对所有超低温冰箱进行24 h温度监测，如遇冰箱温度异常立即发送报警短信提醒工作人员；（7）将以往所采集的组织样本定期批量的进行RNA质量控制，监控样本质量。

本研究对HCC生物样本库质量控制体系进行了初步探讨，采用RIN值来评定RNA的质量水平。该参数已经成为RNA研究领域内质量评估的黄金标准。同时对28S/18S比值也进行了分析，证实在超低温条件下保存3个月、6个月的HCC及癌旁组织细胞，其质量均可以获得有效保证，而保存1年的HCC组织细胞样本RNA虽然存在一定程度的降解，但RIN均值> 7.0，依然能够满足后续临床科研的要求。

1 郜恒骏, 朱明华. 重视肿瘤组织库的标准化建设和应用[J]. 中华病理学杂志, 2008, 37(12):797-798.

2 阮亮亮, 郑培永, 杨佳泓, 等. 生物样本库RNA质量控制的方法学验证[J]. 转化医学杂志, 2015, 4(3):161-165.

3 中华人民共和国卫生部. 原发性肝癌诊疗规范(2011年版)[J]. 临床肝胆病杂志, 2011, 27(11):1141-1159.

4 Wang YG, Zheng H, Chen J, et al. The impact of different preservation conditions and Freezing-Thawing cycles on quality of RNA, DNA, and proteins in cancer tissue[J]. Biopreserv Biobank, 2015, 13(5):335-347.

5 张园, 朱琳, 郭文佳, 等. 新疆肿瘤资源库样本质量控制体系建立[J].新疆医科大学学报, 2014, 37(12):1657-1660.

6 白纪刚, 吕毅, 王浩华, 等. 实验用猪胰腺和小肠组织总RNA提取及鉴定[J]. 陕西医学杂志, 2005, 34(10):1182-1184.

7 许传亮, 徐振宇, 孙颖浩, 等. 肾癌组织与癌旁组织RNA降解差异的研究[J]. 中华实验外科杂志, 2003, 20(9):819-820.

8 Kap M, Oomen M, Arshad S, et al. Fit for purpose frozen tissue collections by RNA integrity number-based quality control assurance at the Erasmus MC tissue bank[J]. Biopreserv Biobank, 2014, 12(2):81-90.

9 蒋超, 曹日昇, 陈俊娣, 等. 生物样本库样本质量控制体系建立的初步探索[J]. 江苏医药, 2016, 42(2):198-200, 封3.

Analysis of RNA integrity of hepatocellular carcinoma cells with different cryopreservation times

Cao Guoqiang1, Zhang Feng1, Chen Leiming1, Chen Hai1, Li Biao1, Feng Xiaowen1, Li Hongchun2, Xie Haiyang1, Zhou Lin1.1First Affiliated Hospital, Key Laboratory of Combined Multiorgan Transplantation, Ministry of Public Health, Key Laboratory of Or gan Transplantation, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, China;2Shenzhen Third People’s Hospital, Division of Hepatobiliary Surgery, Shenzhen 518112, China

Zhou Lin, Email: linzhou19@163.com

ObjectiveTo evaluate the quality control system for cryopreservation of hepatocellular carcinoma cells under -80 ℃ as time relapses.MethodsHepatocellular carcinoma tissue was frozen within 24 hours after harvesting and stored for three months, six months and one year under ultra-low temperature respectively（n = 12 for each group）. Hepatocellular carcinoma and paracancerous tissue were identified by HE Staining. Promega automatic nucleic acid extraction instrument was used to extract RNA from HCC cells. RIN（RNA integrity number）value and 28S/18S ratio was evaluated by Agilent 2100 Bioanalyzer.ResultsThe percentage of tumor cells were found in more than 80﹪ of the samples by HE staining, and were considered as qualified samples. The average RIN values and 28S/18S ratios for HCC tissue stored for three months, six months and one year were > 7.0 and > 1.5 respectively. Unpaired t test showed that RIN value of cells stored for one year was decreased significantly compared with that freshly collected samples（7.442±0.674 vs 8.617±0.769, P = 0.001）or samples stored for three months（7.442±0.674 vs 8.275±0.617, P = 0.005）and six months（7.442±0.674 vs 8.175±0.970, P = 0.043）, suggesting the presence of RNA degradation. There was no significant difference between the other groups（P > 0.5）.ConclusionMorphology for tumor cells, RIN value and 28S/18S ratio can be used as indicators for monitoring the quality of liver cancer samples. Sample quality remained good when stored at ultra-low temperatures for three months or six months, although there was a certain degree of RNA degradation for samples that stored for one year.

Liver neoplasms； Histiocytes； RNA； Cryopreservation

2016-07-19）

（本文编辑：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.01.009

浙江省“十二”五基层卫生适宜技术成果转化工程重大项目（2013T301-15）；深圳市三名工程科技计划项目（ZDSYS201504301534057）

310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院卫生部多器官联合移植研究重点实验室 浙江省器官移植重点实验室1；518112 深圳市第三人民医院肝胆外科2

周琳，Email：linzhou19@163.com

曹国强，张峰，陈雷鸣，等. 不同时间下超低温保存肝癌组织细胞RNA完整性的差异分析[J/CD].中华细胞与干细胞杂志（电子版）, 2017, 7(1):49-53.