MCM7、Rb、c-MYC在肝细胞癌中的表达及其在基因通路中的作用

牛广旭 吴士茜 刘志权 刘小慧 田云霄

MCM7、Rb、c-MYC在肝细胞癌中的表达及其在基因通路中的作用

牛广旭 吴士茜 刘志权 刘小慧 田云霄

目的 探讨MCM7、Rb、c-MYC等基因在肝细胞癌中的表达及其在基因通路中的意义。方法 选取2013年1月至2015年8月邯郸市中心医院手术切除的60例原发性肝细胞癌组织进行免疫组化染色，分析MCM7、Rb、c-MYC等基因在肝细胞癌中的表达情况。结果 MCM7蛋白仅在肝细胞癌组织(73.3%)中表达，显著高于正常肝组织和肝硬化组织(P<0.05)；Rb蛋白在肝硬化组织(53.3%)和肝细胞癌组织(58.3%)中表达，两者阳性率之间无统计学差异(P>0.05)；肝细胞癌组织(70.0%)中c-MYC蛋白阳性率显著高于肝硬化组织(35.0%)(P<0.05)。MCM7蛋白的表达与肿瘤直径、AFP、组织分化程度和临床分期有关(P<0.05)，而与病灶数、是否转移及HBsAg是否阳性无关(P>0.05)；Rb蛋白的表达仅与肿瘤组织分化程度有关(P<0.05)；c-MYC蛋白表达与肿瘤组织分化程度和是否转移有关(P<0.05)。MCM7蛋白和Rb阳性率呈显著负相关(γ=-0.712,P=0.038;γ=-0.664,P=0.018)。结论 肝细胞癌的发生是多基因多通路相互作用的结果，多种调控蛋白的异常共同导致肿瘤的发生。

肝细胞癌；MCM7蛋白；Rb蛋白；c-MYC蛋白

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:210～213)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌中最常见的1种类型，分子水平的研究被认为是揭示其发生机制及寻找治疗靶点的突破口[1]。近年来，许多与HCC相关的基因和蛋白不断被发现[2]，如微小染色体维持蛋白7(MCM7)可调节DNA的复制和延伸，与肿瘤形成密切相关；核蛋白癌基因(c-MYC)的产物磷酸化蛋白P62c-mgc具有使肝细胞发生恶性转化的能力；视网膜母细胞瘤易感基因(Rb)促进G0期静止细胞提前进入分裂周期而过度增殖[3]。然而，由于HCC发生的基因通路错综复杂，其发生机制仍未被完全揭示，因此只有了解各癌症相关基因和蛋白间的关系，才能揭示其在HCC发生中的意义。本文通过检测MCM7、c-MYC和Rb在HCC细胞中的表达,分析其相关性，探讨其在基因通路中的意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月至2015年8月邯郸市中心医院手术切除的60例原发性肝细胞癌组织为肝细胞癌组，将此60例患者癌旁(超过肿瘤边界2 cm以上)硬化的肝组织作为肝硬化组，再选取同期入院的25例肝血管瘤组织周边的正常肝组织为对照组。所有肝癌患者术前均未行放疗或化疗及其他治疗。肝细胞癌组和肝硬化组患者中男性47例，女性13例，年龄45～69岁，平均(55.6±2.4)岁；正常组患者中男性15例，女性10例，年龄38～64岁，平均(54.1±2.2)岁。3组患者间性别、年龄无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。肝细胞癌临床分期参照《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》[4]分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级。本文符合医学伦理学规范，医院伦理委员会审查并通过了此次研究。

1.2 主要试剂

鼠抗人单克隆抗体MCM7购于武汉艾美捷公司，鼠抗人单克隆抗体Rb购于北京中杉金桥公司，鼠抗人单克隆抗体C-myc购于武汉博士德公司。

1.3 免疫组织化学染色

切除的组织经10%甲醛固定后用石蜡包埋。将包埋好的标本切4 μm厚后脱蜡至水，室温下将切片浸没于0.3%过氧化氢溶液中15～20 min，然后把切片浸入枸椽酸盐抗原修复液中，再放入100 ℃恒温水槽中，20 min后取出恒温水槽，于室温下继续在修复液中冷却，后用PBS液洗3次，每次5 min。分别加入按1∶100稀释的浓缩型鼠抗人单克隆抗体MCM7、鼠抗人单克隆抗体Rb和鼠抗人单克隆抗体c-MYC，置于4 ℃冰箱过夜。取出后室温静置30 min，滴加二抗37 ℃温浴20 min，PBS水洗3次后滴加辣根过氧化物酶和二氨基联苯胺显色。最后苏木精复染3 min，流水冲洗10 min，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。阴性对照以PBS代替Ⅰ抗作为阴性片，阳性对照为已知的阳性片。

1.4 结果判断

在高倍镜(×400)下观察肿瘤细胞，细胞核或细胞质中出现黄色或棕黄色颗粒判为阳性细胞。每份标本随机选择5个视野，每个视野下计数100个肿瘤细胞，共计500个，计算阳性细胞所占百分比。阳性细胞率≥10%判断为阳性，阳性细胞率<10%判断为阴性。

1.5 记录指标

记录每份肿瘤标本的大小，单发多发、分化程度、有无转移等，其中分化程度按照Edmondson-Steiner分级标准，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级。所有标本观察记录和阅片由2名病理科医师完成和确诊。同时调取每份标本来源的患者术前血清甲胎蛋白(AFP)水平和乙肝表面抗原(HBsAg)记录。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 MCM7、c-MYC和Rb在不同肝组织中表达情况

3种蛋白在正常组织中均为阴性；MCM7蛋白仅在肝细胞癌组织中表达，与正常组织和肝硬化组织比较，差异有统计学意义(P<0.05)；Rb蛋白在肝硬化组织(53.3%)和肝细胞癌组织(58.3%)中表达，两者阳性率之间无统计学差异(P>0.05)；肝细胞癌组织中c-MYC蛋白阳性率(70.0%)显著高于肝硬化组织(35.0%)(P<0.05)。见表1。

表1 MCM7、c-MYC和Rb在不同肝组织中表达情况(例，%)

注：*为与正常组织相比，P<0.05；#为与肝硬化组织相比，P<0.05。

2.2 临床病理特征与MCM7、c-MYC和Rb表达的相关性

MCM7蛋白的表达在不同肿瘤直径、AFP、组织分化程度间差异有统计学意义(P<0.05)，而在不同的病灶数、是否转移及HBsAg是否阳性方面无统计学差异(P>0.05)；Rb蛋白的表达仅在不同肿瘤组织分化程度方面有统计学差异(P<0.05)；c-MYC蛋白表达在不同肿瘤组织分化程度和是否转移方面差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 MCM7与Rb的相关性

MCM7 蛋白阳性率随临床分期升高而升高，而随肿瘤组织分化程度降低而升高；而Rb蛋白的阳性率表现出相反的趋势。2种蛋白阳性率呈显著负相关(γ=-0.712,P=0.038;γ=-0.664,P=0.018)。见表3。

表2 与MCM7、c-MYC和Rb表达的相关因素(例，%)

表3 MCM7与Rb的相关性(例，%)

3 讨论

肝癌是人类最常见的肿瘤之一，其发生和发展过程受多种分子及其组成的机制调控[5]。

Rb基因家族是真核细胞周期调控的关键环节，在细胞周期和分化的调控中起到重要作用，其突变或缺失与视网膜母细胞瘤、乳腺癌、肺小细胞癌及肝癌等多种肿瘤的发生密切相关[6]。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)可抑制Cyclin-CDK激酶活性，使Rb维持去磷酸化的状态与E2F形成复合物，阻断了E2F的转录活性。PDGF、EGF、IL2等生长因子与其相应受体结合，通过信号传递促进Rb磷酸化，磷酸化的Rb释放并解除对转录因子E2F蛋白的抑制[7]，游离的E2F进入核内可与c-MYC、二氢叶酸还原酶、TK及E2F1等基因的启动子结合，促进这些基因的表达，这些基因产物进而促进细胞通过G1/S调控点[8]，使细胞周期继续进行。本研究结果显示，肝细胞癌组织分化越好Rb蛋白阳性率越高，而临床分期越晚Rb蛋白阳性率越低。可能是由于当Rb基因突变或缺失，细胞中游离的E2F数量增加，激活c-MYC等基因，促进G0期静止细胞提前进入分裂周期而过度增殖，导致肿瘤的发生。

以往研究发现[9]，在海拉癌细胞株细胞周期中MCM7及细胞分裂周期蛋白6(Cdc6)位于c-MYC基因上游的DNA复制起始区域。Cdc6参与构成复制起点识别复合物(ORC)，是确保细胞在一个细胞周期中只复制一次的重要因子，也是DNA复制起始和延伸最重要的因子[10]。本研究中MCM7蛋白的表达与肿瘤直径、组织分化程度和临床分期有关(P<0.05)，而与病灶数、是否转移及HBsAg是否阳性无关(P>0.05)。MCM7和Cdc6在S期早期和G1中晚期共集聚在同一个基因c-MYC198bp区段，之后整个S期和G2期分布在序列350 bp区段。同时有研究发现MCM7和ORC1在G1晚期也共集聚在c-MYC198bp区域[11]。因此MCM7在DNA复制、合成中也起到关键作用，MCM7失调促进肿瘤细胞异常增殖，促进肿瘤发生。本研究结果显示，Rb蛋白的表达仅与肿瘤组织分化程度有关(P<0.05)；c-MYC蛋白表达与肿瘤组织分化程度和是否转移有关(P<0.05)。

文献报道[12]，MCM7与Rb相互作用可抑制DNA复制，阻断细胞周期进程。MCM7羧基末端137个氨基酸与Rb相连因子(p107、p130)相互作用形成Rb-MCM7复合物[13]。只有具有催化活性的CyclinD1/CDK4可促使其解离，释放出MCM7，促进复制前复合物(pre-RC)形成[14]。因此Rb缺失将导致DNA异常复制，复制调控机制失去作用。本研究结果显示，MCM7 蛋白阳性率随临床分期升高而升高，而随肿瘤组织分化程度降低而升高；而Rb蛋白的阳性率表现出相反的趋势，即MCM7蛋白与Rb蛋白阳性率呈显著负相关(γ=-0.712,P=0.038;γ=-0.664,P=0.018)。这可能是由于Rb缺失使MCM7表达异常增高，从而启动异常的DNA复制。

综上所述，肝细胞癌的发生是多基因多通路相互作用的结果，多种调控蛋白的异常共同导致肿瘤的发生。

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(编辑：甘 艳)

Expression of MCM7,Rb,c-MYC Protein in Hepatocellular Carcinoma Tissues and Its Effect on Gene Passageway

NIUGuangxu,WUShiqian,LIUZhiquan,etal.

HandanCentralHospital,Handan,056001

Objective To investigate the expression of MCM7,Rb,c-MYC protein in hepatocellular carcinoma tissues and its effect on gene passageway.Methods Tumor tissues of 60 cases of hepatocellular carcinoma were performed immunohistochemistry stain,the expression of MCM7,Rb and c-MYC genes in hepatocellular carcinoma were analyzed.Results MCM7 protein expressed only in HCC tissue(73.3%),which was significantly higher than normal liver tissues and liver cirrhosis tissues(P<0.05).Rb protein expressed in liver cirrhosis(53.3%) and HCC tissues(58.3%),the positive rates between the 2 tissues had no statistical difference(P>0.05).Positive rate of c-MYC protein in HCC tissue(70.0%) was significantly higher than that in liver cirrhosis tissues(35.0%)(P<0.05).The expression of MCM7 was related to tumor size,AFP,differentiation degree and clinical stage(P<0.05),and not related to tumor foci,metastasis and HBsAg(P>0.05).The expression of Rb was related to differentiation degree only(P<0.05).The expression of c-MYC was related to differentiation degree and metastasis(P<0.05).The positive rate of MCM7 was negatively correlated to that of Rb protein(γ=-0.712,P=0.038;γ=-0.664,P=0.018).Conclusion The occurrence of hepatocellular carcinoma is the consequence of polygene and multichannel.Anomaly of multiple protein co-induce the occurrence of hepatocellular carcinoma.

Hepatocellular carcinoma;MCM7 protein;Rb protein;c-MYC protein

056001 河北省邯郸市中心医院(牛广旭，吴士茜，刘小慧，田云霄)；050021 河北省石家庄市第五医院(刘志权)

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.02.011

R735.7

A

1001-5930(2017)02-0210-04

2016-03-24

2016-07-18)