神经元型一氧化氮合酶与胃肠动力障碍关系的研究进展*

肖和达 汤礼军

(610008)

神经元型一氧化氮合酶与胃肠动力障碍关系的研究进展*

肖和达 汤礼军#成都军区总医院全军普外中心

(610008)

一氧化氮合酶(NOS)是体内生成一氧化氮(NO)的关键酶，具有重要的生物学意义。随着对NOS的生化和分子学特征的研究深入，干预NOS-NO途径在胃肠动力障碍中起有重要作用。本文就神经元型一氧化氮合酶(nNOS)与胃肠动力障碍关系的研究进展作一综述。

一氧化氮合酶Ⅰ型； 一氧化氮； 胃肠活动； 肠神经系统

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)分布广泛，主要存在于内皮细胞、巨噬细胞、神经吞噬细胞和神经元细胞中，根据常规分型可分为常态下存在的神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)以及在损伤后诱导表达的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，其中nNOS主要位于中枢神经系统和周围神经系统的神经组织内。胃肠道的神经支配包括外来自主神经和肠神经系统(enteric nervous system, ENS)。ENS由胃肠道壁内神经成分组成，其结构和功能不同于交感神经系统和副交感神经系统，而与中枢神经系统相类似，具有完整的反射弧，在胃肠动力的神经调节中起有重要作用。NO是ENS中非肾上腺素非胆碱能(non-adrenergic non-cholinergic, NANC)神经的主要抑制性神经递质之一，ENS中NOS阳性神经元分泌的NO在刺激胃肠道分泌以及松弛胃肠道平滑肌中发挥重要作用[1]。既往动物实验已证实ENS中NOS阳性神经元数量改变与胃肠动力障碍具有一定相关性。本文就nNOS与胃肠动力障碍的关系作一综述。

一、nNOS

1. nNOS的生物学特性：nNOS基因位于人染色体12q24.2～24.3上，由1 434个氨基酸残基构成，相对分子质量达160.8 kDa(1 Da=0.992 1 u)[2]。

2. nNOS的分布：nNOS主要集中在神经元细胞、巨噬细胞和星形胶质细胞，在心肌细胞、骨骼肌和平滑肌中亦有分布，在细胞中主要定位于质膜，但在神经胶质细胞中可定位于细胞核[3]。NOS免疫反应阳性产物主要分布于胃肠道黏膜层上皮细胞、内分泌细胞、血管内皮细胞、固有层组织细胞和肌间神经丛以及黏膜下神经丛神经节细胞，特别是胃窦和幽门部，对胃肠道蠕动起重要的调控作用[4-6]。

3. nNOS活性的调控：nNOS活性的调控受多方面影响，首先在转录水平上可能存在转录调控，如应切力、张力、低氧以及细胞因子等可对其活性产生影响；其次，翻译水平上mRNA稳定性对NOS活性起有重要作用，nNOS在剪切中因缺乏编码钙调蛋白(CaM)结构域的外显子，拼接后将失去转化左旋精氨酸(L-arginine，L-Arg)的活性；对于翻译后修饰，NOS磷酸化是快速调节酶活性的一种方式，NOS可被蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)、Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶(CaMK)磷酸化，其中CaMK磷酸化可使NOS活性显著下降；此外，各种底物以及辅助因子均能干预NOS活性[7-8]。nNOS包含两个催化结构域，分别是C末端的还原结构域和N末端的氧化结构域，其中C端与细胞色素P450还原酶具有显著的同源性，含有类似还原酶的血红素辅基-铁原卟啉Ⅸ，故NOS一条多肽链上包含了氧化酶和还原酶催化活性的不同结构域，极有可能是真核生物系统中惟一自给自足的P450酶[9-11]。二聚体是nNOS的活性形式，其形成需结合四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin, BH4)、亚铁血红素和L-Arg，近年研究多认为BH4为NO合成的必须辅助因子[4,12]。

二、NO的合成

NO是一种极不稳定的生物自由基，分子小，微溶于水，具有脂溶性，可快速透过生物膜扩散，生物半衰期仅3～5 s。NOS是体内合成NO的限速酶，在胃肠道动力调节中起关键作用。人体消化道中从口腔到肛门均有NOS分布，其中小肠分布最多；胃肠壁各层均可见NOS，其中环形平滑肌中最多。NOS催化合成NO机制目前并不十分清楚，但公认包括两个单氧化过程。首先，一分子O2、一分子还原型辅酶Ⅱ(NADPH)和BH4反应生成中间产物N-羟基-精氨酸(NHA)，然后在黄素辅酶参与下继续氧化生成L-胍氨酸、NADP+和NO，生成的NO立即与细胞质内的鸟苷酸环化酶发生反应，使环磷鸟苷(cGMP)生成增加来发挥其生理作用。因NOS是Ca2+/CaM依赖性酶，生理条件下由Ca2+激动剂触发的酶活性持续时间短暂(数秒钟)，从而导致Ca2+/CaM水平对NOS的活性控制敏感，亦是NO合成的敏感因素[13]。

三、nNOS对胃肠动力的调控

1. NO在胃肠道中的作用：体内合成的NO几乎参与了人体各种疾病的发生过程[9,14]。NO在消化系统中可能参与调节胃肠黏膜血流、调节胃肠黏膜分泌功能以及保护胃肠黏膜，但目前NO对胃肠动力调节作用的研究结果存在一定差异[4,15-17]。NO为ENS中重要的抑制性NANC神经递质，与其他NANC神经递质发挥协同调节胃肠道运输的作用，特别是食管下端、幽门、回盲瓣肛门等重要分界点的括约肌。目前一般认为NO增多，括约肌松弛，但有研究发现胃肠动力改变的肠壁肌间神经节中NOS阳性神经元未见明显改变[18-20]。

2. nNOS调控胃肠动力的机制：胃肠蠕动依靠胃肠平滑肌的收缩产生，平滑肌收缩继发于动作电位，而动作电位是在慢波去极化的基础上产生的，慢波是胃肠蠕动的基本电节律，受胃肠道起搏细胞Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal, ICC)的调控[21-22]。NO具有高度脂溶性，合成后以扩散的方式到达靶细胞ICC等，与细胞中可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylyl cyclase, SGC)结合，通过改变SGC的空间构型来提高酶活性，从而使细胞内cGMP生成增加，激活依赖cGMP蛋白激酶的钙泵，最终参与细胞间的信息传递[23]。研究表明当cGMP激活蛋白激酶G(PKG)，PKG阻止Ca2+内流或促进Ca2+跨膜转运出细胞，PKG同时也可选择性抑制肌浆网释放或促进钙泵将Ca2+泵回肌浆网，引起胞质内Ca2+降低[7,10]。由此可见，作为nNOS阳性神经元细胞与胃肠平滑肌细胞间信息传递的信使，NO增加使Ca2+内流减少，直接促使平滑肌舒张。此外，有研究证实NO可抑制兴奋性递质释放来抑制肌肉收缩[24]。

3. 肠道nNOS与胃肠动力相关研究：胰腺炎大鼠胃肠动力改变时，肠黏膜下以及肌间神经元中NOS表达无明显变化；甚至有实验发现伴有胃肠动力障碍的急性坏死性胰腺炎大鼠回肠NOS蛋白表达下降[16-18,23]。有研究发现nNOS基因敲除大鼠胃部明显扩张且幽门括约肌肥大，这与婴幼儿肥大性幽门狭窄的病理非常相似，说明胃排空蠕动与机体nNOS表达有密切关系。此外，研究发现先天性巨结肠症是直肠平滑肌和肠肌间神经丛中缺乏NOS所致[5-6]。由此可见，人体胃肠运动与nNOS表达存在密切联系。

四、总结与展望

NO可由nNOS以及其另外两种同工酶作用于L-Arg转化产生，目前已用于心血管疾病、胃肠动力障碍、重症呼吸系统疾病、神经痛以及神经退行性疾病等的治疗中。健康状态下机体各部位NO浓度以及NOS活性维持在一定范围，心血管系统中NO合成减少将对血管内皮丧失保护作用，但神经系统中NO含量增加将产生神经毒性[25]。目前针对体内nNOS活性的研究主要集中于脑神经系统中nNOS抑制剂的研究，nNOS的抑制机制主要包含竞争性抑制底物结合、抑制配体或辅酶、阻止蛋白二聚体形成、拮抗CaM等[9,26]。Lychkova[27]的动物实验证实NOS抑制剂可预防胃食管反流病的发展，NOS抑制剂可改变ENS中nNOS的表达，部分原因可能是ENS可发生重塑，ENS细胞以及胞外组织在受到外部刺激后可发生形态学改变，因此ENS作为直接影响胃肠道功能的一级神经节结构，ENS重塑与胃肠道功能改变密切相关。

nNOS阳性神经元是ENS中主要抑制性神经元之一，调节nNOS活性将直接影响胃肠动力的变化，nNOS主要在正常生理状态下使组织缓慢释放NO，维持机体生理需要量，当机体处于病理状态下肠壁nNOS阳性神经元发生重塑从而影响肠道动力。NO对于血管内皮的保护作用同样适用于肠壁血管，发现其与一些胃肠黏膜保护机制存在联系，这种在同一环境下，NO的不同作用存在将是今后的研究方向。同样，根据目前对脑神经nNOS抑制剂的研究，胃肠动力障碍对nNOS活性的抑制研究也具有一定的临床意义。对于nNOS与胃肠动力障碍的研究，不局限于促进或抑制的关系进展，NO的矛盾作用决定了两者之间的关系是存在相对性的。同时寻找治疗胃肠动力障碍的切入时机可能是今后研究的重点。

1 戴菲, 罗金燕, 龚均, 等. 不同分型功能性便秘患者结肠传输功能、胃肠激素以及一氧化氮合酶的研究[J]. 胃肠病学, 2011, 16 (7): 419-422.

2 Boissel JP, Schwarz PM, Förstermann U. Neuronal-type NO synthase: transcript diversity and expressional regulation[J]. Nitric Oxide, 1998, 2 (5): 337-349.

3 Saini R, Patel S, Saluja R, et al. Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies[J]. J Leukoc Biol, 2006, 79 (3): 519-528.

4 Ravella K, Al-Hendy A, Sharan C, et al. Chronic estrogen deficiency causes gastroparesis by altering neuronal nitric oxide synthase function[J]. Dig Dis Sci, 2013, 58 (6): 1507-1515.

5 Tomuschat C, O’Donnell AM, Coyle D, et al. NOS-interacting protein (NOSIP) is increased in the colon of patients with Hirschsprungs’s disease[J]. J Pediatr Surg, 2017, 52 (5): 772-777.

6 赵煜, 张宏艳, 刘凤林, 等. 神经元型一氧化氮合酶与先天性肥厚性幽门狭窄发病关系的研究[J]. 武警后勤学院学报(医学版), 2014, 23 (2): 107-109.

7 Cain SM, Snutch TP. Voltage-gated calcium channels and disease[J]. Biofactors, 2011, 37 (3): 197-205.

8 Roman LJ, Masters BS. Electron transfer by neuronal nitric-oxide synthase is regulated by concerted interaction of calmodulin and two intrinsic regulatory elements[J]. J Biol Chem, 2006, 281 (32): 23111-23118.

9 陈丽钦, 洪炎国. 神经元型一氧化氮合酶(nNOS)与疼痛[J]. 生命科学, 2010, 22 (5): 426-430.

10 Dai Y, Haque MM, Stuehr DJ. Restricting the conformational freedom of the neuronal nitric-oxide synthase flavoprotein domain reveals impact on electron transfer and catalysis[J]. J Biol Chem, 2017, 292 (16): 6753-6764.

11 Chanrion B, Mannoury la Cour C, Bertaso F, et al. Physical interaction between the serotonin transporter and neuronal nitric oxide synthase underlies reciprocal modulation of their activity[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104 (19): 8119-8124.

12 Heine CL, Kolesnik B, Schmidt R, et al. Interaction between neuronal nitric-oxide synthase and tetrahydrobiopterin revisited: studies on the nature and mechanism of tight pterin binding[J]. Biochemistry, 2014, 53 (8): 1284-1295.

13 Tejero J, Haque MM, Durra D, et al. A bridging interaction allows calmodulin to activate NO synthase through a bi-modal mechanism[J]. J Biol Chem, 2010, 285 (34): 25941-25949.

14 朴海今, 金春子. 一氧化氮合酶在心肌的研究进展[J]. 中国妇幼健康研究, 2016, 27 (1): 236-237.

15 Sibaev A, Fichna J, Saur D, et al. Nociceptin effect on intestinal motility depends on opioid-receptor like-1 receptors and nitric oxide synthase co-localization[J]. World J Gastrointest Pharmacol Ther, 2015, 6 (3): 73-83.

16 Lin Z, Liu Y, Zheng Q, et al. Increased proportion of nitric oxide synthase immunoreactive neurons in rat ileal myenteric ganglia after severe acute pancreatitis[J]. BMC Gastroenterol, 2011, 11: 127.

17 Zhou H, Liu L, Bai Y, et al. Damage of the interstitial cells of Cajal and myenteric neurons causing ileus in acute necrotizing pancreatitis rats[J]. Surgery, 2011, 149 (2): 262-275.

18 林中, 袁园, 李小玲, 等. 重症急性胰腺炎大鼠结肠黏膜下神经节一氧化氮合酶阳性神经元及乙酰胆碱转移酶阳性神经元的改变[J]. 安徽医科大学学报, 2012, 47 (10): 1185-1189.

19 Guo J, Zhu Y, Yang Y, et al. Electroacupuncture at Zusanli (ST36) ameliorates colonic neuronal nitric oxide synthase upregulation in rats with neurogenic bowel dysfunction following spinal cord injury[J]. Spinal Cord, 2016, 54 (12): 1139-1144.

20 Tjong YW, Ip SP, Lao L, et al. Role of neuronal nitric oxide synthase in colonic distension-induced hyperalgesia in distal colon of neonatal maternal separated male rats[J]. Neurogastroenterol Motil, 2011, 23 (7): 666-e278.

21 董艳, 何春梅, 陆金根. 益气开秘方调控肠道Cajal细胞NO-cGMP-PKG通路的实验研究[J]. 上海中医药大学学报, 2013, 27 (3): 82-86.

22 Lammers WJ, Al-Bloushi HM, Al-Eisaei SA, et al. Slow wave propagation and plasticity of interstitial cells of Cajal in the small intestine of diabetic rats[J]. Exp Physiol, 2011, 96 (10): 1039-1048.

23 Toda N, Herman AG. Gastrointestinal function regulation by nitrergic efferent nerves[J]. Pharmacol Rev, 2005, 57 (3): 315-338.

24 Van Geldre LA, Lefebvre RA. Interaction of NO and VIP in gastrointestinal smooth muscle relaxation[J]. Curr Pharm Des, 2004, 10 (20): 2483-2497.

25 Li XL, Zou XM, Nie G, et al. Roles of neuronal nitric oxide synthase and inducible nitric oxide synthase in intestinal transplantation of rats[J]. Transplant Proc, 2013, 45 (6): 2497-2501.

26 丁屹, 蔡鋆鑫, 厉廷有. 神经型一氧化氮合酶竞争性底物抑制剂的研究进展[J]. 中国新药杂志, 2015, 24 (24): 2814-2825.

27 Lychkova AE. Model of gastroesophageal reflux concomitant with functional constipation in conditions of nitric oxide synthase inhibition [Article in Russian] [J]. Eksp Klin Gastroenterol, 2009 (8): 63-66.

(2017-04-02收稿；2017-05-06修回)

ProgressofResearchonRelationshipBetweenNeuronalNitricOxideSynthaseandGastrointestinalMotilityDisorders

XIAOHeda,TANGLijun.

CenterofGeneralSurgery,GeneralHospitalofChengduMilitaryRegion,Chengdu(610008)

TANG Lijun, Email: tlj1316@sina.com

Nitric oxide synthase (NOS) is a key enzyme for production of nitric oxide (NO)invivo. With the deepening of study on biochemical and molecular characteristics of NOS, the intervention of NOS-NO pathway playing an important role in gastrointestinal motility disorder is appreciated. This article reviewed the progress of research on relationship between neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and gastrointestinal motility disorders.

Nitric Oxide Synthase Type Ⅰ; Nitric Oxide; Gastrointestinal Motility; Enteric Nervous System

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.11.011

*本课题由国家自然科学基金(81500409)、四川省科技厅基础研究(2015JY0161)资助

#本文通信作者，Email: tlj1316@sina.com