胃癌荧光分子成像诊断研究进展

贺 玲 综述 刘海峰 审校

胃癌荧光分子成像诊断研究进展

贺 玲 综述 刘海峰 审校

荧光分子成像；胃癌；探针

早期胃癌及癌前病变的筛查与检测主要依赖白光内镜观察病变及活检后的病理定性，而多数早癌形态变化不明显，且病变活检定位又缺乏准确性，漏诊率很高[1]。随着消化内镜新技术的不断发展,各种特殊内镜，如窄谱成像内镜(narrow band imaging，NBI)、智能分光比色技术(fuji intelligent chromo endoscopy，FICE)、放大内镜、超声内镜等应用于临床。这些技术通过强化病变部位黏膜表面构造、增强光学对比度，使病灶与正常黏膜的对比更加明显。但目前仍缺乏大数据证明这些成像方式对病变检出率优于高分辨率白光内镜[2,3]。因此，我们亟需创新性的诊断筛查方式，荧光分子成像为我们提供了新的思路。

1 荧光分子成像的优势

将荧光分子成像与消化内镜融合形成的荧光内窥成像技术，利用荧光标记的探针在分子信号基础上特异性使肿瘤病变发光，能在分子水平而非形态学水平识别和描述病变在体的黏膜特征[4,5]。在白光内镜还未发现早期肿瘤病变时，分子标志物就能帮助区分正常黏膜和早期肿瘤病变，实现可疑病变的靶向性活检,从而提高内镜下病变的检出率[6]，有望成为消化道早癌检测技术的新突破。为什么选择荧光分子成像与消化内镜结合？首先，该成像方式具有快捷简便、无辐射、可短期重复检查、对肿瘤的成像灵敏度可达毫米级等优点[7]；其次，消化道为一天然暗箱，为荧光内窥成像提供了绝佳条件；另外，消化道肿瘤绝大部分起源于黏膜层，内窥成像模式完美地避开了荧光穿透性弱及空间分辨率低的缺点。要想实现荧光分子内窥成像在消化道早期癌诊断中的临床转化需从两方面着手，第一，需要能够与肿瘤病变特异性结合的探针使病变发光；第二，需要相应的荧光内窥设备来激发和捕捉病变部位发出的荧光。目前，胃癌的荧光分子成像依旧处于临床前研究阶段。本文主要围绕胃癌荧光分子成像中的设备和靶向性荧光分子探针两个方面进行综述。

2 光学设备

在临床应用中，荧光内镜诊断病变的理想模式分宏观和微观两步，黏膜表面喷洒或静脉注射荧光探针后，先采用宽视场荧光内窥镜快速筛选大片黏膜确定发光的可疑病变区域，接着利用荧光显微内镜进一步对发光病变放大定性，并在亚细胞水平可视化结合到各自靶点的分子探针[8]。目前，宽视场荧光内窥设备均是自制的实验室原理样机，还未实现商品化[9,10]。荧光显微成像中有共聚焦激光显微内镜(confocal laser endomicroscopy，CLE)实现了商品化且已应用于临床，CLE将荧光显微成像整合到内镜检查中，利用荧光探针可获得组织放大1000倍的光学显微图像，可在胃镜操作中对黏膜进行细胞及亚细胞水平观察，成像效果与病理HE染色(haematoxylin and eosin staining)有良好相关性[8]，有“光学活检”的美誉。临床所用CLE有两种，一种是日本宾得(Pentax)公司的内镜整合式CLE(endoscopeintegrated CLE，eCLE)，将微型共聚焦显微镜内置在白光内镜头端，可调节组织成像平面深度(表层至250 μm)，分辨率为7μm，拍摄速度1帧/s。另一种是法国莫纳克亚公司(Mauna Kea Technologies)的探头式CLE(probe based CLE，pCLE)，能够通过消化内镜的工作通道抵达黏膜，操作灵活，实用性好，成像速度较快(12帧/s)，实现了视频记录，但成像深度固定且成像视野较eCLE小。pCLE的迷你探头有不同的外径和分辨率，可与各种内镜匹配，除了在腔体结构(食管、胃、结肠)，另在导管结构(胆管、胰管)、呼吸系统(肺、支气管)、泌尿系统(尿道、膀胱)均有涉猎，更有细针型CLE(needle based CLE，nCLE)能通过19 G(0.91 mm)的穿刺针，可谓是无孔不入。两种设备的激发光均为488nm，发射光波长505～585nm[8,11,12]。

3 靶向荧光分子探针

靶向荧光分子探针通常由信号组件和亲和组件组成。信号组件指能产生荧光信号的标记部分(如有机荧光染料、量子点等)，亲和组件也可称为靶标，是与生物靶点特异性结合的部分(如抗体、短肽、核酸适体等)。生物靶点在病变细胞表面或细胞质过表达，比如胃癌特异性抗原(MG7、MGb2)[13,14]，细胞表面的一些特异性受体(如表皮生长因子受体[15]、肝细胞生长因子受体[16])等。分子靶点与光学活性探针作用后发出荧光信号，凸显出肿瘤病变。根据靶标的不同，可将荧光分子探针划分为抗体探针、短肽探针、适体探针、可激活探针[8]。

3.1 抗体探针 抗体提供了广泛的靶标多样性，与靶点有较高的亲和力，是细胞外靶点或细胞表面受体的理想成像探针，其标记很好构建。另外，肿瘤分子靶向药中治疗性单克隆抗体更是一类有吸引力的靶标，在分子诊断成像同时还能指导肿瘤的靶向治疗[17]。西妥昔单抗是临床用于治疗高表达表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)结直肠癌患者的分子靶向药。2012年，Hoetker等[18]用荧光染料AlexaFlour488标记西妥昔单抗构建了靶向EGFR的荧光探针，经尾静脉注射到裸鼠胃癌皮下移植瘤模型体内,利用CLE在荷瘤鼠瘤体上观察到西妥昔单抗组荧光强度明显高于对照组(P=0.047)，并在亚细胞水平定位了EGFR的分布。MG7抗原是解放军第四军医大学课题组发现的一种特异性较高的胃癌相关抗原，在胃癌组织中表达率高达94%，在胃癌患者血清中的检出率为83.6%，主要位于细胞膜、细胞浆和腺体，是极具早期诊断价值的胃癌分子标志物[13]。2013年，Li Z等[13]将AlexaFlour488标记的抗MG7单克隆抗体与新鲜人胃癌组织及正常胃组织体外共孵育后利用CLE检测，结果显示23例胃癌组织标本中22例有特异性荧光信号，而非癌组织标本则无或仅有弱荧光信号(P<0.001)。抗体作为探针仍有不足之处：分子量较大，扩散缓慢，到达目标结构的时间较长；有潜在的免疫原性；血清半衰期长，全身应用后易在体内积累，增加了背景噪音，降低了信噪比[17]。

3.2 短肽探针 相对抗体而言，短肽由少数氨基酸组成，具有分子量小、组织穿透力强、低免疫原性等优点，是另一类常用的靶向性荧光探针[19]。在过去的几十年，从噬菌体展示肽库(109)中筛选特异性靶向短肽配体有了大量研究。2013年，Xin J等[20]用新合成的对称花青染料(CyIC)标记胃癌血管靶向肽GX1(该实验室前期从随机噬菌体肽库中筛选出了与人胃癌血管内皮细胞特异性结合的环形九肽CGNSNPKSC[21])，构建了新型胃癌靶向荧光探针CyIC-GX1，小动物活体成像结果证明该探针对胃癌组织具有良好的靶向性，且细胞毒性低、光稳定性好。2015年Liu L等[22]从噬菌体随机环七肽库筛选出了能特异性识别胃癌组织血管内皮细胞的短肽CTKNSYLMC(GEBP11)，利用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记GEBP11，构建探针FITC-GEBP11，经人胃癌裸鼠皮下及原位移植瘤模型尾静脉注射该探针后24 h进行CLE在体成像，结果显示与对照组相比两种小鼠模型瘤体处均有明显的荧光信号(P<0.05)；将人胃癌组织与FITC-GEBP11孵育，离体组织CLE成像显示28例胃癌标本中26例表现出不同强度的荧光。另有研究筛选出了靶向CD44的短肽RP-1，与肝细胞生长因子(c-Met蛋白)稳定结合的新型大环肽aML5-FL，并用荧光染料标记构建相应探针，成功完成了人胃癌细胞，人胃癌裸鼠皮下移植瘤的荧光分子成像[23,16]。虽大多数短肽探针没有明确对应的生物靶点，但通过与靶细胞特异性结合的荧光检测，完全可以进行疾病的诊断。

3.3 核酸适体探针 核酸适体是从随机寡核苷酸文库经体外指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)筛选出的能特异性结合蛋白质或其他小分子物质的单链核苷酸片段(ssDNA或RNA)[24]。与短肽相似，因其分子量小，所以具有更加理想的药代动力及组织分布特性，同时体外筛选成本低、周期短、易于合成修饰，与靶分子结合条件可控，靶标物质范围广泛(如有机小分子、蛋白质、病毒甚至细胞等)，是新一代理想探针之一[25]。对比短肽文库，筛选适体的寡核苷酸文库通常数目体积更大(1016)。上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)在许多固体肿瘤中过表达，在肿瘤诊断成像、预后、治疗应用中是一个较为理想的靶点[26]。2013年，Song Y等[27]用SELEX技术得到了一组特异性识别EpCAM及EpCAM表达阳性细胞的ssDNA适体SYL3C。实验结果证明，SYL3C能在多种细胞混合液中特异性识别表达EpCAM的肿瘤细胞，用FITC标记SYL3C与胃癌细胞孵育后，共聚焦荧光显微镜观察到人胃癌细胞表面有较强的荧光。另一研究利用胃癌细胞AGS作为靶细胞，经cell-SELEX技术，从最终富集的ssDNA池得到一个胃癌细胞特异性DNA适体(cy-apt20)，经人胃癌荷瘤鼠模型尾静脉注射荧光染料Cy5标记的cy-apt20 60min后，在肿瘤位点探测到的荧光强度约为对照组5倍，证实适体cy-apt20有作为胃癌靶向分子探针的潜力[28]。此外，还有科研团队筛选出与HGC27细胞亲和力和特异性最高的适体AGC03，将羧基荧光素(FAM)标记的AGC03与各种胃癌细胞、非胃癌细胞孵育。结果显示AGC03同其他胃癌细胞系(BGC823, MGC803和SGC7901)也有结合能力，且亲和力高，与起源于其他组织的肿瘤细胞(如肺癌、肝癌)无结合，该研究表明新兴的适体探针对胃癌的临床诊断和靶向治疗有很好的促进作用[29]。

3.4 “智能”探针 与以上几种活化探针相比，“智能”探针具有可激活的特点，它们开始为失活状态，只有当特定的靶物质存在时才能被激活产生荧光信号，从而具有比其它探针更高的信号背景比[17]。其靶点多为肿瘤过表达的酶类，靶标为对应的底物。2012年，Ding S等[30]利用商业化的组织蛋白酶可激活探针ProSense®680和基质金属蛋白酶可激活探针MMPSense®750FAST，对Smad4+/-裸鼠原位胃癌移植瘤模型进行在体荧光成像，在肿瘤感兴趣区域探测到荧光强度分别是对照组的1.8倍和2.2倍。目前，“智能”探针文献报道的种类较少，但这种具有创新性的“可激活”理念，能实现更佳的成像信噪比，相信未来科学家们定会致力于开发新型高效的荧光激活探针。

3.5 纳米探针 为综合多种分子影像技术的优点，基于纳米探针的多模态成像应运而生,研究者对靶标进行多重标记后可利用不同成像方式检测肿瘤病变。上海交大科研团队证实乳腺癌相关抗原1(breast cancer related antigen 1，BRCAA1)约在65%的人胃癌组织中过表达，将其作为靶点成功构建了抗BRCAA1单抗耦合荧光磁性纳米颗粒(FMNPs)的纳米探针(抗BRCAA1-FMNPs)，完成了荷瘤鼠模型中胃癌组织(直径约5 mm)的荧光/磁共振双模态诊断成像[31]。另外，Wang P等[32]利用致密纳米二氧化硅(dSiO2)包裹超顺磁性氧化铁纳米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPION)形成壳-核纳米颗粒，然后在壳外耦联抗CD146单抗(YY146)和荧光染料800ZW构建了纳米探针800ZW-SPION@dSiO2-YY146，实验结果表明该纳米探针与胃癌细胞的结合能力是对照组的14倍，经尾静脉注射探针至胃癌皮下荷瘤鼠体内，利用小动物活体成像仪观察，发现注射探针后30 min能观察到瘤体的荧光，24 h达峰值，同时在瘤体部位能检测强烈的磁共振信号。GEBP11作为靶向肿瘤血管内皮细胞的短肽，Su T等[33]利用其对胃癌组织的靶向特异性，构建了荧光/磁共振双模态纳米探针Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNP(CGD-MNP)，同样体内荧光/磁共振成像显示CGD-MNP在SGC-7901荷瘤鼠模型中成功可视化了肿瘤血管生成。基于双模态的纳米探针分子成像，集合了核磁共振成像高空间分辨率以及光学成像高灵敏度等优点，彼此取长补短，能够更加精准的对病变进行诊断。除磁共振成像外，荧光成像还可以与正电子发射断层扫描成像[34]、超声成像等[35,36]其他成像方式结合应用，多模态分子成像从多角度、多维度观察病变的生理过程，为临床诊断提供更全面的影像学信息，会成为未来肿瘤分子诊断成像的一个重要方向。

虽然荧光分子成像在胃癌诊断中取得了大量临床前研究成果，但要向临床转化，依旧任重道远。应用于临床的理想靶向探针应该毒性低、稳定性好、生物相容性好、特异性高、灵敏度高，并且适合大批量合成、生产[37]。然而，现阶段的胃癌靶向性荧光分子探针离以上要求尚远，故日后研发靶向性胃癌荧光分子探针时，不仅需要提高其靶向性，也需要应用多种新型材料、完善合成方法与检测方法来合成满足临床需求的靶向性胃癌荧光探针。现今，食管和结肠病变的荧光分子成像已有人在体研究成果报道[38,39]。相信在不久的将来，胃癌荧光分子诊断技术也会有突破性进展。

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(2016-11-08收稿 2017-01-19修回)

(责任编辑 岳建华)

本刊“临床病例讨论”栏目征稿通知

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1.病例选择： (1)选择的病例要具有代表性且不涉及医院敏感问题，优先录取多学科交叉病例；(2) 诊断明确，但病情危重、治疗棘手的病例；(3) 罕见病例。以上病例须最终获得明确诊断或成功治疗，临床资料应齐全，能提供实验室、影像学和病理确诊依据。

2.写作格式： 正文分“病例介绍”和“临床讨论”两部分。病例介绍：交代清楚患者主诉、病史(包括既往史)，实验室、影像学及病理学检查结果、临床诊断、治疗方案、治疗结果等(需要提供影像学检查的图片)。临床讨论：为主体内容，首先提出目前病例诊断治疗的进展和需要解决的问题等讨论要点；之后由参加会诊的知名专家点评，写清诊断和治疗思路、鉴别诊断要点、治疗上应注意的问题等，为今后的临床工作提供借鉴和参考。若为罕见病，则介绍目前国内外的最新进展。会诊专家需署名(如无外请专家，也可署本院科主任名)，格式如：张某某医师(肝胆科)。具体行文格式参考本栏目已发表的论文格式。全文字数3800或6500左右。

来稿请在右上角标注“临床病例讨论”。本栏目所录稿件为原创性临床研究论文，欢迎广大临床医师踊跃投稿！

武警医学编辑部

2017年1月

国家自然科学基金项目(81471700)

贺 玲，硕士研究生。

100039 北京，武警总医院消化内科

刘海峰，E-mail:haifengliu333@163.com

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