P-选择素基因S290N和P-选择素糖蛋白配体-1基因M62I多态性与缺血性脑梗死临床关联性研究

李滔，王昌富，梅冰，李琳芸，姚长江，龚道凯，胡小辉

·论著·

P-选择素基因S290N和P-选择素糖蛋白配体-1基因M62I多态性与缺血性脑梗死临床关联性研究

李滔，王昌富，梅冰，李琳芸，姚长江，龚道凯，胡小辉

目的 探讨P-选择素(SELP)基因S290N和P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)基因M62I多态性与缺血性脑梗死的关系。方法 选取148例缺血性脑梗死患者作为脑梗死组，并分为大动脉粥样硬化性(LAA)亚组、心源性脑栓塞(CE)亚组和小动脉闭塞性(SAO)亚组；88例正常人群作为正常对照组。运用基因测序方法检测所有受试者SELP基因S290N和PSGL-1基因M62I的基因多态性。结果 与正常对照组比较，脑梗死组及其亚组S290N基因型和等位基因频率差异无统计学意义(均P>0.05)；脑梗死组M62I基因型和等位基因频率差异有统计学意义(均P<0.01)；LAA亚组M62I基因型差异无统计学意义(χ2=5.889，P=0.053)，但等位基因频率差异有统计学意义(χ2=6.156，P=0.021)；CE亚组基因型和等位基因频率差异均无统计学意义(χ2=1.693，P=0.429；χ2=1.372，P=0.238)；SAO亚组基因型和等位基因频率差异均有统计学意义(χ2=12.572，P=0.002；χ2=8.736，P=0.004)。S290N与缺血性脑梗死风险无相关性(均P>0.05)。M62I显性模型和超显性模型与缺血性脑梗死风险有相关性(OR=2.662，95%CI: 1.531～4.630，P=0.000；OR=0.392，95%CI：0.219～0.701，P=0.001)，而隐性模型和加性模型与缺血性脑梗死风险无相关性(OR=1.428，95%CI：0.528～3.862，P=0.630；OR=2.121，95%CI：0.766～5.872，P=0.156)。结论 PSGL-1基因M62I多态性与缺血性脑梗死之间具有相关性。

P-选择素；P-选择素糖蛋白配体-1；缺血性脑梗死；基因多态性；亚型

缺血性脑梗死是全世界第二个最常见的死亡原因，在亚洲排名第一[1-2]。世界卫生组织(WHO)估计到2050年，世界上80%的脑梗死病例发生在低收入和中等收入国家，主要是印度和中国[3]。脑梗死形成的原因复杂，起因于血管、环境和遗传因素[4]。大量的研究[5-8]表明，P-选择素(SELP)和P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)在动脉粥样硬化和血栓的形成等血管因素中起着重要作用。而单核苷酸多态性使得基因在转录翻译时蛋白质的结构功能和表达水平发生变化，从而影响疾病的易感性及临床表现的多样性。本研究主要探讨SELP基因S290N和PSGL-1基因M62I多态性与缺血性脑梗死及其亚型的关系。

1 对象与方法

1.1 对象 (1)脑梗死组：选取2015年3月～2015年9月入住我院的148例缺血性脑梗死患者，均为首次发病且在24 h内入院，符合2013年美国心脏协会卒中委员会(AHA)/美国卒中协会(ASA)发布的21世纪脑梗死新定义的诊断标准[9]。男77例，女71例;年龄36～90岁，平均(65.2±11.8)岁。按照TOAST分型标准，将脑梗死组分为大动脉粥样硬化性脑梗死(LAA)亚组30例，心源性脑栓塞(CE)亚组24例和小动脉闭塞性或腔隙性脑梗死(SAO)亚组94例。(2)正常对照组：系同期我院体检中心健康体检者88名，男36名，女52名;年龄49～89岁，平均(68.5±9.7)岁。排除高血压、冠心病、糖尿病、高血脂等心血管疾病和代谢性疾病。两组间年龄、性别差异无统计学意义，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 全血DNA的提取 脑梗死组于入院后，正常对照组于体检当日清晨空腹采集受试者静脉血2 ml于EDTA-K2抗凝管中，使用Takara Blood Genome DNA Extraction Kit试剂盒提取基因组DNA，于-70℃保存备用。

1.2.2 引物设计和合成 根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的Genebank库中SELP基因S290N (rs6131)和PSGL-1基因M62I (rs2228315)位点附近260 bp序列，在线设计引物，由Takara宝生物工程(大连)有限公司合成。SELP基因S290N和PSGL-1基因M62I引物序列和基因型见表1。

表1 SELP基因S290N和PSGL-1基因M62I引物序列和基因型SNP位点SNP编号引物序列所在外显子密码子编码氨基酸基因型SELPrs6131F:5'-GTGCAGACCAGTGTCCAGAGT-3'7AGT丝氨酸SSSNNNS290NR:5'-CCTGCATTTCAGAGGTGGTT-3'AAT天冬氨酸PSGL-1rs2228315F:5'-CAGCTCCGTGGTCAGCTCT-3'2ATG甲硫氨酸MMMIIIM62IR:5'-TGTGGGACACCTGGGCAGAT-3'ATA异亮氨酸

1.2.3 PCR扩增 反应体系：10×Ex Taq Buffer (Mg2+free) 2.5 μl，MgCl2(25 mmol)2 μl，dNTP Mixture(各2.5 mmol)2 μl，TaKaRa Ex Taq 1.0 U，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各1 μl，模板DNA 3 μl，补足灭菌蒸馏水至25 μl。反应条件：在ABI 7300荧光定量PCR仪上扩增。42℃ 5 min，95℃ 3 min，98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃ 10 min。扩增产物纯化和基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件包进行统计学处理。计数资料以率表示，基因型和等位基因频率比较采用χ2检验。用Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验各基因型和等位基因频率是否已达到遗传平衡，是否具有群体代表性。显性、隐形、加性和超显性遗传模型评估多态性与疾病发生的风险程度。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 脑梗死组与正常对照组基因检测结果的比较 SELP基因S290N位点具有多态性，包括SS、SN、NN共3种基因型。M62I位点亦具有多态性，包括MM、MI、II共3种基因型。SELP和PSGL-1基因型在两组人群中的分布频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡，具有群体代表性。经χ2检验，S290N基因型和等位基因频率在两组间差异无统计学意义(χ2=1.596，P=0.450;χ2=0.501，P=0.479)(表2)。M62I基因型和等位基因频率在两组间差异有统计学意义(χ2=12.554，P=0.002;χ2=9.512，P=0.002)(表3)。

表2 各组间SELP基因S290N基因型和等位基因频率的比较(例,%)组别基因型SSSNNN等位基因SN脑梗死组(n=148)93(63)50(34)5(3)236(80)60(20) LAA亚组 (n=30)21(70)9(30)0(0)51(85)9(15) CE亚组 (n=24)14(58)9(38)1(4)37(77)11(23) SAO亚组 (n=94)58(62)32(34)4(4)148(79)40(21)正常对照组(n=88)61(69)23(26)4(5)145(82)31(18)

表3 各组间PSGL-1基因M62I基因型和等位基因频率的比较(例,%)组别基因型MMMIII等位基因MI脑梗死组(n=148)66(45)68(46)14(9)200(68)96(32) LAA亚组 (n=30)13(43)13(43)4(14)39(65)21(35) CE亚组 (n=24)13(54)9(38)2(8)35(73)13(27) SAO亚组 (n=94)40(43)46(49)8(8)126(67)62(33)正常对照组(n=88)60(68)22(25)6(7)142(81)34(19)

2.2 不同亚型脑梗死患者与正常对照组SELP基因S290N和PSGL-1基因M62I的基因型和等位基因频率的比较 见表2、3。脑梗死组LAA亚组、CE亚组、SAO亚组患者SELP S290N基因型(χ2=1.488，P=0.475;χ2=1.198，P=0.549;χ2=1.352，P=0.509)和等位基因频率(χ2=0.217，P=0.696;χ2=0.696，P=0.409;χ2=0.777，P=0.428)与正常对照组差异无统计学意义。与正常对照组比较，LAA亚组PSGL-1基因M62I基因型差异无统计学意义(χ2=5.889，P=0.053)，但等位基因频率差异有统计学意义(χ2=6.156，P=0.021);CE亚组基因型和等位基因频率差异均无统计学意义(χ2=1.693，P=0.429;χ2=1.372，P=0.238);SAO亚组基因型和等位基因频率差异均有统计学意义(χ2=12.572，P=0.002;χ2=8.736，P=0.004)。

2.3 SELP基因S290N和PSGL-1基因M62I多态性与缺血性脑梗死风险分析 见表4。S290N与缺血性脑梗死风险无相关性(均P>0.05)。M62I显性模型和超显性模型与缺血性脑梗死风险有相关性(OR=2.662，95%CI: 1.531～4.630，P=0.000;OR=0.392，95%CI：0.219～0.701，P=0.001)，而隐性模型和加性模型与缺血性脑梗死风险无相关性(OR=1.428，95%CI：0.528～3.862，P=0.630;OR=2.121，95%CI：0.766～5.872，P=0.156)。

表4 SELP基因S290N和PSGL-1基因M62I多态性与缺血性脑梗死风险分析项目OR值95%CIP值SELPS290N 显性模型0.7480.426～1.3140.326 隐形模型0.7340.192～2.8100.730 加性模型0.8200.212～3.1751.000 超显性模型1.4420.803～2.5880.246PSGL-1M62I 显性模型2.6621.531～4.6300.000 隐形模型1.4280.528～3.8620.630 加性模型2.1210.766～5.8720.156 超显性模型0.3920.219～0.7010.001

3 讨 论

编码SELP基因定位于人类1号染色体(1q21-24)上一段50 kb的DNA序列，包含17个外显子和16个内含子[10-12]。S290N位点位于外显子7，此外显子编码第三个补体调节蛋白样功能区。编码PSGL-1基因定位于人类12号染色体(12q24)上，包含2个外显子和1个内含子[13]。M62I位点靠近PSGL-1与SELP结合绑定的区域[14]。这两个位点的突变可能会影响基因的转录。由于基因转录效率不同，转录产物的结构和功能可能会有所差别，从而影响一些相关疾病发生与发展。

本研究结果显示，脑梗死组与正常对照组PSEL基因S290N基因型和等位基因频率差异无统计学意义，与既往研究[15-17]一致。并且，脑梗死组LAA亚组、CE亚组、SAO亚组患者SELP基因S290N基因型和等位基因频率与正常对照组差异无统计学意义。S290N与缺血性脑梗死风险无相关性。提示此多态性位点不是缺血性脑梗死发病的危险因素。SELP第三个补体调节蛋白样功能区可能与缺血性脑梗死无相关性。

本研究结果显示，M62I基因型和等位基因频率在两组间差异有统计学意义，这与既往研究[16,18]报道的一致。进一步分型发现，与正常对照组比较，LAA亚组PSGL-1基因M62I基因型差异无统计学意义，但等位基因频率差异有统计学意义;CE亚组基因型和等位基因频率差异均无统计学意义;SAO亚组基因型和等位基因频率差异均有统计学意义。造成这种差别的原因可能与PSGL-1参与缺血性脑梗死发病机制有关。M62I位点靠近PSGL-1与SELP结合绑定的区域，目前认为其多态性可能与SELP和PSGL-1相互作用的能力相关。活化的血小板通过SELP与血管内皮细胞上表达的PSGL-1相结合，刺激血管内皮细胞Weibel-Palade小体释放大量的SELP[19]，并且促使血管内皮细胞释放一系列炎症因子和趋化因子，募集白细胞，出现炎性表现。由于PSGL-1基因M62I多态性使得PSGL-1和SELP相互作用的能力不同，黏附在血管内皮细胞上的血小板介导白细胞的俘获和滚动的能力也不同。另一方面，血小板活化后SELP表达增加，其特异的与白细胞上表达的PSGL-1结合，形成血小板白细胞聚集体(PLA)[20-21]。循环中的PLA通过白细胞上表达的PSGL-1与血管内皮细胞上高表达的SELP结合，捆绑PLA，抵抗血流的高剪切力，有利于其他细胞黏附分子的共同作用和血小板活化因子对PLA的激活，启动动脉粥样硬化的进程，受累的大动脉管壁增厚管腔狭窄，继而引发LAA。SAO是由于长期高血压使血液冲击血管内膜，受损内膜易为胆固醇、脂质沉积，可导致脑内深穿支小动脉的玻璃样变，受累小动脉管壁增厚管腔狭窄。血压长期不稳定还可造成小动脉痉挛，管壁纤维素样坏死，进而引起脑组织多发性小梗死。虽然SELP和PSGL-1在高血压炎症中的作用机制目前还不清楚。但越来越多的研究[22-23]表明，高血压患者的外周血白细胞和血小板处于一定程度的炎症激活状态。而CE主要是由于心房纤颤或感染性心内膜炎等心脏基础性疾病患者左心房或左心室内形成血栓，栓子脱落随血流进入体循环栓塞到远端小动脉导致局部供血区域脑梗死。SELP在血栓的形成中发挥一定作用，它可介导血小板在受损的血管内皮细胞黏附和聚集，参与凝血。而PSGL-1基因M62I主要影响PSGL-1和SELP的绑定，其多态性与心源性血栓的形成可能并无关联。

本研究风险因素分析显示，PSGL-1基因M62I显性模型(MI+II VS MM)和超显性模型(MM+II VS MI)与缺血性脑梗死风险有相关性，而隐性模型(II VS MM+MI)和加性模型(MM VS MI VS II)与缺血性脑梗死风险无相关性。显性模型分析说明M62I中I等位基因为显性基因。携带I等位基因的患者，发生缺血性脑梗死的风险是不携带I等位基因的患者的2.662倍(95%CI：1.531～4.630，P=0.000)。超显性模型分析提示与杂合突变型MI相比，野生型MM和纯和突变型II患病的风险性降低(OR=0.392，95%CI：0.219～0.701，P=0.001)。

总之，本研究发现，PSEL基因S290N基因多态性与缺血性脑梗死及其病因学亚型无相关性。PSGL-1基因M62I基因多态性与缺血性脑梗死尤其是SAO有相关性。PSGL-1 M62I中I等位基因会增加患缺血性脑梗死的风险。由于缺血性脑梗死发病机制复杂，心脑血管危险因素众多，基因多态性存在地域和种族差异，关于SELP和PSGL-1基因多态性与缺血性脑梗死的关系还需进一步研究。

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Clinical relevance research of polymorphism of P-selectin gene S290N and P-selectin glycoprotein ligand-1 gene M62I in ischemic cerebral infarction

LITao,WANGChang-fu,MEIBin,etal.

DepartmentofClinicalLaboratory,JingzhouHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Jingzhou434020,China

Objective To investigate the correlation of P-selectin (SELP) gene S290N polymorphisms and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) gene M62I polymorphisms with ischemic cerebral infarction. Methods One hundred and forty-eight ischemic cerebral infarction patients were in cerebral infarction group, and these patients were divided into large artery atherosclerosis cerebral infarction (LAA) subgroup, cardioembolism (CE) subgroup and small artery occlusion cerebral infarction (SAO) subgroup. Eighty-eight healthy controls were in normal control group. Polymorphisms of SELP gene S290N and PSGL-1 gene M62I of all subjects were detected by gene sequencing.Results Compared with normal control group, there was no significant difference of frequency of S290N genotype and allele in cerebral infarction group and its subgroup (allP>0.05). Compared with normal control group, there was significant differences of frequency of M62I genotype and allele in cerebral infarction group (allP<0.01). Compared with normal control group, there was no significant difference of M62I genotype in LAA subtypes group (χ2=5.889,P=0.053). Compared with normal control group, there was significant difference of M62I allele frequency in LAA subgroup (χ2=6.156,P=0.021). Compared with normal control group, there was no significant difference of M62I genotype and allele frequency in CE subgroup (χ2=1.693,P=0.429;χ2=1.372,P=0.238). Compared with normal control group, there were significant differences of M62I genotype and allele frequency in SAO subgroup (χ2=12.572,P=0.002;χ2=8.736,P=0.004). S290N gene had no correlation with the risk of ischemic cerebral infarction (allP>0.05). However, dominant and over-dominant models of M62I were associated with therisk of ischemic cerebral infarction (OR=2.662, 95%CI: 1.531-4.630,P=0.000;OR=0.392, 95%CI: 0.219-0.701,P=0.001), while recessive and additive models of M62I were not (OR=1.428, 95%CI: 0.528-3.862,P=0.630;OR=2.121, 95%CI: 0.766-5.872,P=0.156).Conclusion PSGL-1 gene M62I polymorphism is correlated with ischemic cerebral infarction.

P-selectin；P-selectin glycoprotein ligand-1；ischemic cerebral infarction；gene polymorphism；subtype

434020荆州，华中科技大学同济医学院附属荆州医院检验医学部(李滔，王昌富，梅冰，李琳芸)，神经内科(姚长江，龚道凯，胡小辉)

王昌富

R743

A

1004-1648(2017)01-0024-05

2015-10-20

2016-02-22)