MACROD2基因rs2208454单核苷酸多态性与脑出血的关系研究

李海华，江东东，肖友生，罗立忠，单小芳，罗曼

·论著·

MACROD2基因rs2208454单核苷酸多态性与脑出血的关系研究

李海华，江东东，肖友生，罗立忠，单小芳，罗曼

目的 研究MACROD2基因rs2208454单核苷酸多态性与脑出血(ICH)的关系。方法 采用SNaPshot方法检测124例ICH患者(ICH组)及149名正常对照者(对照组)的rs2208454单核苷酸多态性。结果 与对照组比较，ICH组及脑叶出血亚组收缩压、舒张压及高血压史、糖尿病史比率显著增高(均P<0.05)，非脑叶出血亚组收缩压、舒张压及高血压史、糖尿病史、饮酒史比率显著增高(均P<0.05)。与对照组比较，TT、GT、GG基因型分布在ICH组及其亚组差异均无统计学意义(均P>0.05)。非条件Logistic回归分析显示，SNP rs2208454与ICH无相关性(均P>0.05)。亚组分析中，SNP rs2208454与非脑叶出血及脑叶出血亦无相关性(均P>0.05)。结论 rs2208454单核苷酸多态性与ICH不相关。

脑出血；rs2208454；MACROD2；单核苷酸多态性

脑出血(ICH)是一种高致残率和致死性的疾病，造成沉重的健康和经济负担。众多研究[1-2]显示，ICH是遗传因素和环境因素共同作用所致的复杂疾病，易感基因在ICH发病中起到了一定的作用。最近一项全基因组关联研究[3]发现，MACROD2基因rs2208454单核苷酸多态性(SNP)位点变异携带者静默型脑梗死的患病风险降低。由于ICH可能具有与静默型脑梗死相似的病理生理过程[4]，推测ICH也可能与SNP rs2208454相关。因此，本研究以ICH患者及健康人群作为研究对象进行了病例对照研究，以确定SNP rs2208454与ICH之间的关联。

1 对象与方法

1.1 对象 本研究采用病例-对照研究方法，病例来自两个研究中心(中山大学附属第一医院及广西医科大学第一附属医院)。(1)ICH组：收集2011年1月～2012年12月就诊于神经科的ICH患者124例，诊断符合疾病国际分类标准第10版标准，所有病例均经CT和/或MRI确诊。男75例，女49例；年龄28～84岁，平均(63.9±13.3)岁。排除继发性ICH和蛛网膜下腔出血，以及严重感染、慢性阻塞性肺病、各系统肿瘤、严重慢性疾病患者。由两位神经科医师盲法按出血部位对ICH患者进行分型[5]。将ICH患者分为三亚组：非脑叶出血亚组93例、脑叶出血亚组28例以及混合(同时存在非脑叶及脑叶部位的出血)出血亚组3例。(2)对照组：系同期健康体检者149名，男78名，女71名；年龄35～84岁，平均(62.6±10.4)岁。排除患有脑血管病、冠心病、慢性阻塞性肺病、各系统肿瘤、严重感染、内分泌及代谢性疾病(除外糖尿病)、自身免疫性疾病、血液病以及严重肝肾功能不全者等系统性疾病患者。两组的性别、年龄相匹配，均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基因分型方法 (1)血液基因组DNA提取：抽取研究对象外周静脉血2 ml，EDTA 抗凝。使用全血基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司)提取基因组DNA。PCR扩增：引物使用Primer3软件设计(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)，上游引物序列：5′-GCC AGA TTA GAT CTG AGC TAG GGT GT-3′，下游引物序列：5′-TCC AAA ATA AAC CAG CAA CCA AAA-3′，PCR反应体系(20 μl)包含：1×GC缓冲液Ⅰ，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U热启动Taq聚合酶，1 μl样本DNA和2 μl PCR引物(1 μmol/L)。PCR反应条件：95℃预变性2 min；94℃变性20s ，65℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，11个循环；94℃变性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，24个循环；最后72℃延伸2 min。PCR产物4 ℃保存。(2)SNP基因分型：取PCR产物15 μl，依次加入虾碱酶5 U、外切酶2 U，此后37℃温浴1 h，75℃灭活15 min。继而进行单碱基延伸反应延伸。延伸引物序列：TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TGC CCC CCA TTT ACT TTG ATT TTA T。反应体系包括：SNaPshot反应试剂盒5 μl，纯化后PCR产物2 μl，延伸引物1 μl，超纯水2 μl。反应条件：96℃预变性1 min；96℃变性10 s，52℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，28个循环；4℃保存。在10 μl延伸产物中继续加入虾碱酶1 U，37 ℃温浴1 h，75℃灭活15 min，以纯化延伸产物。取0.5 μl纯化后的延伸产物，变性后在3130XL测序仪上样，采用GeneMapper 4.1分析。

2 结 果

2.1 ICH组和对照组临床资料的比较 见表1。与对照组比较，ICH组及脑叶出血亚组收缩压、舒张压及高血压史、糖尿病史比率显著增高(均P<0.05)，非脑叶出血亚组收缩压、舒张压及高血压史、糖尿病史、饮酒史比率显著增高(均P<0.05)，混合出血亚组高血压史比率显著增高(P<0.05)。

表1 脑出血病例组与对照组临床资料的比较(x±s,例,%)项目对照组(n=149)ICH组(n=149)总体(n=149)非脑叶出血亚组(n=93)脑叶出血亚组(n=28)混合出血亚组(n=3)年龄(岁)62.6±10.463.9±13.363.4±13.465.9±12.961.0±16.5男性78(52.3)90(60.5)58(62.4)15(53.6)2(66.7)饮酒史15(10.1)24(16.1)18(19.4)*1(3.6)1(33.3)吸烟史32(21.5)43(29.0)28(30.1)6(21.4)2(66.7)高血压史28(18.8)119(79.8)*75(80.6)*21(75.0)*3(100.0)*糖尿病史9(6.0)37(25.0)*20(21.5)*10(35.7)*1(33.3)ICH家族史1(0.7)7(4.8)5(5.4)1(3.6)0(0)收缩压(mmHg)129.8±18.7150.6±25.5*152.4±24.7*145.9±27.7*136.0±31.2舒张压(mmHg)79.8±11.689.0±16.4*89.3±16.3*88.3±16.4*84.7±22.4胆固醇(mmol/L)5.1±1.35.2±1.25.1±1.15.4±1.5-三酰甘油(mmol/L)1.4±1.01.5±1.01.5±0.91.7±1.1-糖化血红蛋白(%)6.2±1.36.4±1.46.3±1.26.6±2.0- 注:与对照组比较*P<0.05;1mmHg=0.133kPa

2.2 HWE检验结果 对照组及ICH组均符合HWE平衡法则(χ2=0.006，P=0.934；χ2=0.121，P=0.728)，具有群体代表性。

2.3 组间基因型分布的比较 见表2。与对照组比较，TT、GT、GG基因型分布在ICH组及其亚组差异均无统计学意义(均P>0.05)。

2.4 不同遗传模型下SNP rs2208454与ICH患病风险的关系 见表3。为调整ICH环境因素的影响，以ICH作为因变量，以年龄、收缩压、舒张压、高血压史及糖尿病史等作为混杂因素予以校正，进行非条件Logistic回归分析。遗传模型包括显性(TT+GT vs. GG)、隐性(TT vs. GT+GG)和加性(TT vs.GG)模型。分析显示，SNP rs2208454与ICH无相关性(显性模型：OR=1.03，95%CI: 0.64～1.67，P=0.90，校正OR=0.80，95%CI：0.42～1.49，P=0.48; 隐性模型：OR=1.22，95%CI：0.47～3.17，P=0.69，校正OR=0.79，95%CI：0.22～2.86，P=0.72; 加性模型：OR=1.22，95%CI：0.46～3.24，P=0.69，校正OR=0.77，95%CI：0.21～2.80，P=0.69)。亚组分析中，SNP rs2208454与非脑叶出血及脑叶出血亦无相关性(均P>0.05)。

表2 ICH组与对照组SNPrs2208454基因型分布的比较(例,%)组别SNPrs2208454基因型TTGTGGχ2值P值ICH组9(7.26)46(37.10)69(55.64)0.160.92 非脑叶出 血亚组8(8.60)33(35.48)52(55.92)0.600.74 脑叶出 血亚组1(3.57)12(42.86)15(53.57)0.460.80对照组9(6.04)56(37.58)84(56.38)

表3 不同遗传模型下SNPrs2208454与ICH患病风险的关系遗传模型校正前OR值95%CIP值校正后OR值95%CIP值ICH组 显性模型1.030.64～1.670.900.800.42～1.490.48 隐性模型1.220.47～3.170.690.790.22～2.860.72 加性模型1.220.46～3.240.690.770.21～2.800.69非脑叶出血亚组 显性模型1.020.61～1.720.940.760.38～1.530.45 隐性模型1.460.54～3.940.451.000.26～3.811.00 加性模型1.440.52～3.960.480.930.24～3.540.91脑叶出血亚组 显性模型1.120.50～2.520.781.000.38～2.631.00 隐性模型0.580.07～4.740.610.530.05～5.770.60 加性模型0.620.07～5.280.660.630.05～7.330.71

3 讨 论

ICH是一种复杂疾病，它的发病受环境因素和遗传因素的共同影响。大量研究[6]表明，环境因素中高血压是ICH最主要的独立危险因素。本研究显示，ICH组收缩压及舒张压均明显高于对照组。亚组研究中虽然非脑叶出血亚组和脑叶出血亚组收缩压及舒张压均较对照组增高，但非脑叶出血亚组升高更为明显，这符合既往的研究[7-8]结果。糖尿病是否是ICH一个危险因素尚存在争议。有研究[6]认为，糖尿病与ICH无显著相关。也有研究[9]认为，糖尿病是ICH的独立危险因素。本研究结果显示，糖尿病与ICH相关。此外，非脑叶出血亚组的饮酒史与对照组有统计学差异，提示饮酒可能是ICH的危险因素之一，这与既往的研究[10]结果一致。

鉴于不同的脑出血亚型，其病理特征、发病原因均不同，因此本研究小组认为ICH的易感基因多态性研究有必要根据不同亚型进一步进行亚组研究。本研究根据出血部位不同将脑出血分为非脑叶出血、脑叶出血及混合出血亚组。脑叶出血指出血部位为脑叶及皮质下白质的出血，其病理生理机制主要是脑淀粉样血管病[11]。已有大量研究[12]证实，载脂蛋白E基因变异与CAA发病相关，是较公认的可增加脑叶出血发病风险的易感基因。非脑叶出血包括基底节区、脑室旁白质、丘脑、内囊及小脑、脑干出血。非脑叶出血的病因主要为高血压性血管病变[13]。既往研究显示[4,13-15]，可能与非脑叶出血相关的基因有ACE、PMF1/SLC25A44、COL4A2及MTHFR等，此外还有出凝血、脂代谢、炎症等相关的基因与脑出血发病相关的报道[13]，但目前尚未发现较明确的非脑叶出血的易感基因。

新近一项基于社区人群的MRI确定的静默型脑梗死全基因组关联研究[3]发现，位于20p12的MACROD2基因rs2208454是与静默型脑梗死最相关的SNP位点(OR=0.76，95%CI：0.68～0.84，P=4.64×10-7)，该位点变异携带者静默型脑梗死的患病风险降低。静默型脑梗死患者无任何(或仅有极轻微的)临床症状、体征而达不到“缺血性脑卒中”的诊断，但可经MRI检查发现，大多数是位于皮质下的腔隙性梗死。此外，一些研究[16-17]显示，MACROD2基因多态性还与缺血性脑卒中及高血压有关。由于ICH和腔隙性脑梗死同属于脑小血管病，可能具有相似的发病机制，因此易感基因也可能存在重叠。SNP rs2208454位于MACROD2基因第3内含子，位于富含亮氨酸的纤连蛋白跨膜蛋白3(FLRT3)基因的下游区域。由MACROD2编码的蛋白质的功能目前尚不清楚。MACROD2基因包含一段绑定腺苷二磷酸(ADP)-核糖的区域，提示MACROD2有可能参与到ADP-核糖基化过程中。ADP-核糖基化是以NAD作为修饰基团的供体，将ADP核糖连接到受体蛋白上去的一种翻译后修饰过程。ADP核糖基化作用几乎存在所有类型的细胞中，已被认为是生物体修饰和改变蛋白质结构和功能的最重要途径之一。生物体内很多重要事件都与ADP-核糖基化作用密切相关，涉及DNA修复、转录激活、基因的表达与调控等。另外，FLRT3基因位于rs2208454的上游，是除MACROD2外距离rs2208454最近的基因。FLRT3基因编码富含亮氨酸的纤连蛋白跨膜蛋白3，它在包括脑在内的各种组织中均有表达。该蛋白调节细胞间的嗜同性黏附和上调成纤维细胞生长因子的信号，提示FLRT3基因编码蛋白可能参与神经、血管发生。在动物实验[18]中已有证据表明，FLRT3能够在轴索损伤后促进轴突生长。目前，尚无MACROD2基因SNP rs2208454与ICH相关性研究报道。本研究结果发现，在本研究人群中存在MACROD2基因rs2208454多态性，存在TT、GT和GG三种基因型。与对照组比较，TT、GT、GG基因型分布在ICH组及其亚组差异均无统计学意义(均P>0.05)。SNP rs2208454与ICH及各亚组均无相关性。但由于SNP rs2208454位于MACROD2基因的内含子区域，并不参与蛋白质的编码，因此还无法得知ICH发病与MACROD2基因功能是否相关。

综上所述，本研究采用病例对照研究MACROD2基因SNP rs2208454与ICH患者的遗传易感性的关联，结果显示rs2208454与ICH发病无关。这可能和抽样不均有关，仍需扩大样本量进一步验证。

[1]Park HJ, Kim SK, Park HK, et al. Association between paraoxonase gene polymorphisms and intracerebral hemorrhage in a korean population[J]. J Mol Neurosci, 2015, 57: 410.

[2]唐玉兰，秦培英，黄芩，等.广西地区壮,汉族原发性脑出血患者凝血因子ⅩⅢ亚单位Pro564Leu基因多态性的研究[J].临床神经病学杂志，2011，24：102.

[3]Debette S, Bis JC, Fornage M, et al. Genome-wide association studies of MRI-defined brain infarcts: meta-analysis from the CHARGE Consortium[J]. Stroke, 2010, 41: 210.

[4]Rannikmäe K, Davies G, Thomson PA, et al. Common variation in COL4A1/COL4A2 is associated with sporadic cerebral small vessel disease[J]. Neurology, 2015, 84: 918.

[5]Martini SR, Flaherty ML, Brown WM, et al. Risk factors for intracerebral hemorrhage differ according to hemorrhage location[J]. Neurology, 2012, 79: 2275.

[6]O’donnell MJ, Xavier D, Liu L, et al. Risk factors for ischaemic and intracerebral haemorrhagic stroke in 22 countries (the INTERSTROKE study): a case-control study[J]. Lancet, 2010, 376: 112.

[7]van de Woestijne AP, van der Graaf Y, de Bakker PI, et al. LDL-c-linked SNPs are associated with LDL-c and myocardial infarction despite lipid-lowering therapy in patients with established vascular disease[J]. Eur J Clin Invest, 2014, 44: 184.

[8]Zia E, Pessah-Rasmussen H, Khan FA, et al. Risk factors for primary intracerebral hemorrhage: a population-based nested case-control study[J]. Cerebrovasc Dis, 2006, 21: 18.

[9]Emerging Risk Factors Collaboration, Sarwar N, Gao P, et al. Diabetes mellitus, fasting blood glucose concentration, and risk of vascular disease: a collaborative meta-analysis of 102 prospective studies[J]. Lancet, 2010, 375: 2215.

[10]Poon MT, Bell SM, Al-Shahi Salman R. Epidemiology of intracerebral haemorrhage[J]. Front Neurol Neurosci, 2015, 37: 1.

[11]蒋小群，郝子龙，王秋筱，等.脑出血患者出血部位与病因构成的相关性研究[J].中国脑血管病杂志，2013，10：259.

[12]Charidimou A, Martinez-Ramirez S, Shoamanesh A, et al. Cerebral amyloid angiopathy with and without hemorrhage: evidence for different disease phenotypes[J]. Neurology, 2015, 84: 1206.

[13]Carpenter AM, Singh IP, Gandhi CD, et al. Genetic risk factors for spontaneous intracerebral haemorrhage[J]. Nat Rev Neurol, 2016, 12: 40.

[14]Lindgren A. Stroke genetics: a review and update[J]. J stroke, 2014, 16: 114.

[15]张进，陆磊，施弘，等.亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与脑出血的关系[J].临床神经病学杂志，2004，17：267.

[16]Luo M, Li JX, Sun XS, et al. The single nucleotide polymorphism rs2208454 confers an increased risk for ischemic stroke: a case-control study[J]. CNS Neurosci Ther, 2014, 20: 893.

[17]Slavin TP, Feng T, Schnell A, et al. Two-marker association tests yield new disease associations for coronary artery disease and hypertension[J]. Hum Genet, 2011, 130: 725.

[18]Leyva-Díaz E, Del Toro D, Menal MJ, et al. FLRT3 is a Robo1-interacting protein that determines Netrin-1 attraction in developing axons[J]. Curr Biol, 2014, 24: 494.

Relationship between single nucleotide polymorphism rs2208454 in MACROD2 gene and intracerebral hemorrhage

LIHai-hua,JIANGDong-dong,XIAOYou-sheng,etal.

DepartmentofNeurology,FusuiPeople’sHospital,Chongzuo532100,China

Objective To explore the relationship between single nucleotide polymorphism (SNP) rs2208454 in MACROD2 gene and intracerebral hemorrhage (ICH). Methods The SNP rs2208454 of 124 ICH patients (ICH group) and 149 normal controls (control group) was detected by SNaPshot technique. Results Compared with control group, systolic pressure, diastolic blood pressure and the rate of hypertension and diabetes of ICH group and lobar ICH subgroup were significantly increased (allP<0.05), systolic pressure, diastolic blood pressure and the rate of hypertension, diabetes and drinking of nonlobar ICH subgroup were significantly increased (allP<0.05). Compared with control group, the distribution genotypes (TT, GT, GG) of ICH group and its subgroups had no statistically significant difference (allP>0.05). Non-conditional Logistic regression analysis showed SNP rs2208454 had no correlation with ICH (allP>0.05). In subgroup analysis, SNP rs2208454 had no correlation with nonlobar and lobar ICH (allP>0.05). Conclusion SNP rs2208454 has no correlation with ICH.

intracerebral hemorrhage；rs2208454；MACROD2；single nucleotide polymorphism

广西自然科学基金(2013GXNSFBA019131,2015GXNS FAA139171)

532100 崇左，扶绥县人民医院神经内科(李海华，罗立忠，单小芳)；广西医科大学第一附属医院神经内科(江东东，肖友生，罗曼)

罗曼

R743.34

A

1004-1648(2017)01-0005-04

2016-03-17

2016-08-10)