5种常见致病菌菌液OD值与其活菌数相关性研究

林静，何佳茜，尚翠玲，孟佳丽，李昕，金天明

比浊法又称浊度测定法，是一种光散射测量技术，通过测量透过悬浮质点介质的光强度来确定悬浮物质浓度的方法。在实际应用中，比浊法的用途非常广泛，有研究者利用细菌的不同特点，对采用紫外-可见分光光度测定细菌浓度的方法进行探讨，在一定浓度内吸光度与浓度呈良好的线性关系[1-7]。在本次试验中，比浊法主要用作测量5种常见致病菌菌液中的细菌数量（包括活菌、死菌），并结合平板计数法，进一步弥补比浊法计数的缺点，得到快速细菌计数的方法[8]。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所需菌种：大肠杆菌、巴氏杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、牛链球菌，均为本实验室保存，所需培养基见表1。

表1 菌种与其对应培养基

1.2 方法

1.2.1 菌液OD值的测定

（1）一级种子液的制备。将复苏后的菌种用接种环挑取单个菌落于相应的液体培养基进行扩大培养，摇床37℃恒温培养过夜，为一级种子液。

（2）二级种子液的制备。吸取250 μL一级种子液加入到6 mL液体培养基中，吹打混匀，为二级种子液。

（3）生长曲线分析仪的设置。将Bioscreener全自动生长曲线分析仪测定程序设置为培养温度37℃，时长18 h，平均30 min/次，波长600 nm。

（4）OD值的测定。用移液枪分别吸取200 μL二级种子液依次放入仪器测试专用孔板中，并对测试所用孔进行标记。分别取1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18 h时的细菌菌液，测定其OD600值。

1.2.2 菌落平板计数

采用平板菌落计数法。将菌液进行 10、102、103、……、10n倍比稀释，每稀释度重复3次，吸取1 mL稀释后的菌液注入对应的固体培养基上，并用无菌涂棒涂布均匀后放入37℃恒温箱过夜培养。当固体培养基上的菌落数为30～300 CFU/mL时，即为合适的稀释倍数，并取3次测量的平均值。计数平板上的平均菌落数乘以其稀释倍数，即为1 mL菌液中的活菌数（CFU/mL）。

1.2.3 数量关系分析

对数据进行整理分析显示，在细菌生长的对数期，菌液中活菌数与其OD600值之间存在着一定的数量关系，并得到相应数量关系方程。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌的计数结果及分析

2.1.1 大肠杆菌的计数结果

大肠杆菌在各个时间点的OD600值、平板计数的平均菌落数（n）、稀释倍数、1 mL菌液活菌数（N），如表2所示。

2.1.2 大肠杆菌线性回归方程

测定大肠杆菌菌液在1.5～10 h 6个时间点的OD600值，以其为x轴，以活菌数为y轴，得到一条活菌数关于OD600值的数学曲线（图1），并得出相关的回归方程。

表2 大肠杆菌数值汇总

图1 大肠杆菌OD600值与活菌浓度数量关系图

2.2 巴氏杆菌的计数结果及分析

2.2.1 巴氏杆菌的计数结果

巴氏杆菌各个时间点的OD600值、平板计数的平均菌落数（n）、稀释倍数、1 mL菌液活菌数（N），如表3所示。

表3 巴氏杆菌数值汇总

2.2.2 巴氏杆菌线性回归方程

以巴氏杆菌在1.5～10 h 6个时间点的OD600值为x轴，以活菌数为y轴，得到一条活菌数关于OD600值的数学曲线（图2），并得出相关的回归方程。

图2 巴氏杆菌OD600值与活菌浓度数量关系图

2.3 金黄色葡萄球菌的计数结果及分析

2.3.1 金黄色葡萄球菌的计数结果

金黄色葡萄球菌各个时间点的OD600值、平板计数的平均菌落数（n）、稀释倍数、1 mL菌液活菌数（N），如表4所示。

表4 金黄色葡萄球菌数值汇总

2.3.2 金黄色葡萄球菌线性回归方程

以金黄色葡萄球菌在1.5～10 h 6个时间点的OD600值为x轴，以活菌数为y轴，得到一条活菌数关于OD600值的数学曲线（图3），并得出相关的回归方程。

图3 金黄色葡萄球菌OD600值与活菌浓度数量关系图

2.4 表皮葡萄球菌的计数结果及分析

2.4.1 表皮葡萄球菌的计数结果

表皮葡萄球菌各个时间点的OD600值、平板计数的平均菌落数（n）、稀释倍数、1 mL菌液内活菌数（N），如表5所示。

表5 表皮葡萄球菌数值汇总

2.4.2 表皮葡萄球菌线性回归方程

以表皮葡萄球菌在1.5～10 h 6个时间点的OD600值为x轴，以活菌数为y轴，得到一条活菌数关于OD600值的数学曲线（图4），并得出相关的回归方程。

图4 表皮葡萄球菌OD600值与活菌浓度数量关系图

2.5 牛链球菌的计数结果及分析

2.5.1 牛链球菌的计数结果

牛链球菌各个时间点的OD600值、平板计数的平均菌落数（n）、稀释倍数、1 mL体积内活菌数（N），如表6所示。由于10 h时间点的OD600值误差过大，不利于生长曲线的拟合，将其舍弃。

2.5.2 牛链球菌线性回归方程

取牛链球菌在1.5～12 h 6个时间点的OD600值，并以其为x轴，以活菌数为y轴，建立一条活菌数关于OD600值的数学曲线（图5），并得出相关的回归方程。

表6 牛链球菌数值汇总

图5 牛链球菌OD600值与活菌浓度数量关系图

3 讨论与结论

在实际生产中，细菌计数是细菌研究中一项基础且重要的工作。此次试验的目的就是得到一种快速、便捷的细菌计数方法。细菌在生长过程中，平台期后虽然细菌总数在逐渐增多，但死菌数量会越来越多，而活菌数却越来越少。在细菌相关试验中，由于对数生长期的细菌生长状态良好，符合比尔定律的要求，测量值一般处于0.2～1.2之间，菌液中内毒素、外毒素含量较少等原因而被经常使用[9]。吴海燕等[10]对不同转速下大肠杆菌OD600值与时间的关系进行探讨，为快速而准确的制备高感受态细胞提供OD600值的量化标准，其研究中所使用的待测菌液就取自于对数生长后期。罗如松等[11]采用类似的方法，阐明了猪胸膜肺炎放线杆菌生长特性、细菌悬液浊度与细菌计数的关系，其试验结果显示，随着时间的推移，细菌处于稳定生长后期和衰亡期，可能因为细菌的代谢活性降低、有毒产物的积累、细胞出现自溶现象等原因，导致菌液中存在有大量死亡的细菌和细胞碎片进而影响测量。因此，在进行生长曲线拟合度测定时，对细菌对数期的OD600值与对数期的活菌数进行数据处理，才可以得到拟合度高、有较强实际意义的数量方程[12]。

本试验通过菌液OD600值与菌液活菌数量的比对，可得出数量关系方程。分别为：大肠杆菌：y＝8 708.7e36.43x（R2＝0.828）；巴氏杆菌：y＝34.82e35.57x（R2＝0.866）；金黄色葡萄球菌：y＝49 331e28.16x（R2＝0.743）；表皮葡萄球菌：y＝4×108e24.73x（R2＝0.928）；牛链球菌：y＝8×109e68.21x（R2＝0.971）。将比浊法与数学模型相结合，代入OD600值即可快速得出相应的细菌活菌数量，R2值越接近于1，计算获得的活菌数量越为准确。分析5种细菌的菌液OD600值与菌液中活菌数量的关系方程可知，表皮葡萄球菌、牛链球菌的数量关系方程在统计学上有着较强的意义，生产实践中可以有效地简化试验步骤，节约生产成本。

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