Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达量检测对慢性乙型肝炎患者病情评估的价值*

孙立华，朱斌，周艳彩，张光文

（新乡医学院第一附属医院 感染疾病科，河南 新乡 453100）

Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达量检测对慢性乙型肝炎患者病情评估的价值*

孙立华，朱斌，周艳彩，张光文

（新乡医学院第一附属医院 感染疾病科，河南 新乡 453100）

D O I：10.3969/j.i s s n.1005-8982.2017.03.014

目的分析外周血中辅助性T细胞17（Th17）表面C C趋化因子受体4（C C R 4）、C C趋化因子受体6（C C R 6）、C X C亚族趋化因子受体3（C X C R 3）表达量检测对慢性乙型肝炎患者病情评估的价值。方法选取2013年8月-2015年12月在该院接受治疗的乙型肝炎患者118例作为观察组，同期在该院接受健康体检的肝功能正常人群142例作为对照组，对比两组外周血Th17细胞表面C C R 4、C C R 6、C X C R 3表达水平，血清纤维化指标及肝功能指标，并进一步分析C C R 4、C C R 6、C X C R 3表达量与慢性乙肝患者病情严重程度的相关性。结果慢性乙肝患者的外周血Th17细胞表面C C R 4、C C R 6、C X C R 3表达水平，透明质酸（H A）、层黏连蛋白（LN）、Ⅳ型胶原（Ⅳc）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）值，丙氨酸转移酶（ALT）、白蛋白（Al b）、总胆红素（TBIL）值均高于对照组，球蛋白（G l o）值低于对照组，随着慢性乙肝病情加重，外周血Th17细胞表面C C R 4、C C R 6、C X C R 3表达水平，H A、LN、Ⅳc、PCⅢ值，ALT、Al b、TBIL值进一步上升，G l o值下降。C C R 4、C C R 6、C X C R 3表达量与慢性乙肝患者的外周血H A、LN、Ⅳc、PCⅢ、ALT、Al b、TBIL呈正相关，与G l o呈负相关（P＜0.05）。结论慢性乙肝患者存在外周血Th17细胞表面C C R 4、C C R 6、C X C R 3异常表达，其与患者病情严重程度直接相关，可以作为乙肝治疗的新靶点。

慢性乙型肝炎；Th17细胞；病情评估

慢性乙型肝炎是我国最常见的慢性传染性疾病，抗病毒治疗是其主要治疗手段。但是近年研究显示，单纯抗病毒治疗的效果不甚明显，许多患者病情迁延甚至逐步加重向肝硬化发展。最新研究显示，辅助性T细胞17（T hel per cel l 17，Th17）在慢性乙型肝炎患者的外周血和肝组织中表达上升，可能成为慢性乙肝治疗的新靶点。本研究中重点检测Th17细胞表面CC趋化因子受体4（CC chem oki ne recept or，CCR4）、CC趋化因子受体6（CC chem oki ne recept or，CCR6）、CXC亚族趋化因子受体3（Chem oki ne CXC m ot i f recept or 3，CXCR3）的表达量，并进一步分析其表达水平与慢性乙肝病情的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年8月-2015年12月在本院接受治疗的慢性乙型肝炎患者118例作为观察组，符合世界卫生组织（W orl d H eal t h Organi zat i on，W H O）对于慢性乙型肝炎的诊断标准[1]，且既往未接受过抗病毒治疗的患者。118例患者中男性63例，女性55例；年龄13～53岁，平均（35.39±8.27）岁。按照病毒性肝炎防治方案中对于慢性乙型肝炎的诊断及分级标准[1]，①轻度：病情较轻，伴乏力、头晕、食欲减退、肝区不适，肝稍肿大，可伴有轻度脾肿大，肝功能指标中存在1、2项轻度异常；②中度：症状体征及实验室指标介于轻度及重度之间；③重度：伴明显、持久的肝炎症状，伴明显肝掌、蜘蛛痣、脾大，实验室指标中天冬氨酸氨基转移酶反复升高，伴白蛋白降低、丙种球蛋白水平显著升高。所有入组患者轻度47例，中度51例，重度20例。另取同期在本院接受健康体检的肝功能正常人群142例作为对照组，其中男性76例，女性66例；年龄15～59岁，平均（36.28±8.11）岁。本研究经医院伦理委员会审核并批准，所有入组对象在了解研究过程后签署知情同意书，两组患者的性别、年龄等基线资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。轻度慢性乙肝患者中男性25例，女性22例；年龄14～53岁，平均（35.81±7.49）岁。中度慢性乙肝患者中男性28例，女性23例。年龄13～51岁，平均（35.14±8.54）岁。重度慢性乙型肝炎患者中男性10例，女性10例；年龄14.52岁，平均（35.52± 7.91）岁。轻、中、重度慢性乙肝患者的性别、年龄资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达的检测

抽取所有入组患者的治疗前、晨起空腹肘静脉血5 m l，置入抗凝管中，并用Fi col l密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peri pheral bl ood m ononucl ear cel l，PBM C）。将无菌PBM C用培养基调节浓度至1× 106个/m l，放入24孔板，加入刺激剂、伊屋诺霉素及阻断剂后，在37℃、5%二氧化碳CO2条件下培养5 h。CD3、CD4、CD8表面标记染色固定，室温避光放置20 m i n，洗涤细胞后用流式细胞仪检测CD4+Th17细胞、CD8+Th17细胞占总淋巴细胞百分率、Th17细胞表面趋化因子受体CCR4、CCR6、CXCR3表达百分率。

1.3 血清纤维化指标的检测

在相同情况下抽取研究对象的空腹外周静脉血2 m l，室温静置后2 000 r/m i n离心15 m i n，取上清并用酶联免疫吸附法（enzym e-l i nked i m m unosorbent assay，ELISA）测定其中纤维化指标，包括透明质酸（H yal uroni c aci d，H A）、层黏连蛋白（Lam i ni，LN）、Ⅳ型胶原（Ⅳ-col l agen，Ⅳc）及人Ⅲ型前胶原（precol l agenⅢ，PCⅢ）。

1.4 肝功能指标的检测

获取患者晨起空腹外周静脉血2 m l后，离心取上清并用大型自动生化仪检测肝功能指标，包括丙氨酸转氨酶（al ani ne am i not ransf erase，ALT）、总胆红素（t ot al bi l i rubi n，TBIL）、白蛋白（Al bum i n，Al b）、球蛋白（Gl obul i n，Gl o）等。

1.5 统计学方法

数据处理采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多个总体均数的比较用方差分析，组间两两比较用LSD-t检验法，相关性分析用Pearson法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3的表达

慢性乙肝患者和对照组外周血Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），慢性乙肝患者外周血Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达水平高于对照组。慢性乙肝轻、中、重度患者外周血Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。慢性乙肝病情越重，Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达水平越高。见表1。

表1 各组患者外周血Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达比较 （%±s）

表1 各组患者外周血Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达比较 （%±s）

CD4+Th17CD8+Th17组别CXCR3轻度乙肝组（n=47） 9.73±0.83 6.46±0.78 28.36±3.46 9.26±0.85 5.11±0.59 40.22±5.32中度乙肝组（n=51） 15.32±1.91 11.25±1.74 35.46±4.62 13.27±1.43 7.09±0.85 58.29±7.12重度乙肝组（n=20） 26.47±3.29 19.26±2.53 52.36±6.09 18.39±2.36 10.27±1.54 63.27±7.38对照组（n=142） 5.27±0.68 4.09±0.56 21.27±3.56 7.11±0.89 3.42±0.56 31.28±5.73 F值 9.341 8.264 10.382 7.725 8.391 9.276 P值 0.015 0.021 0.013 0.027 0.018 0.016CCR4CCR6CXCR3CCR4CCR6

2.2 血清纤维化指标

慢性乙肝患者和对照组血清H A、LN、Ⅳc、PCⅢ水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），慢性乙肝患者血清H A、LN、Ⅳc、PCⅢ水平高于对照组。慢性乙肝轻、中、重度患者血清H A、LN、Ⅳc、PCⅢ水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。慢性乙肝病情越重，血清H A、LN、Ⅳc、PCⅢ水平越高。见表2。

表2 各组患者的血清纤维化指标比较 （ng/m l±s）

表2 各组患者的血清纤维化指标比较 （ng/m l±s）

组别H ALNⅣcPCⅢ轻度乙肝组（n=47） 38.27±5.12 31.56±4.88 28.51±4.02 14.37±2.54中度乙肝组（n=51）79.43±10.43 92.41±12.3776.43±9.52 58.32±7.23重度乙肝组（n=20）154.03±28.49 183.46±30.48213.42±32.37153.29±32.48对照组（n=142） 19.27±3.52 17.18±3.09 15.27±2.71 6.17±0.94 F值 9.238 11.289 12.472 9.834 P值 0.016 0.012 0.011 0.014

2.3 肝功能指标

慢性乙肝患者和对照组血清ALT、Al b、TBIL、Gl o水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），慢性乙肝患者血清ALT、Al b、TBIL水平高于对照组，Gl o水平低于对照组。慢性乙肝轻、中、重度患者血清ALT、Al b、TBIL、Gl o水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。慢性乙肝病情越重，血清ALT、Al b、TBIL水平越高，Gl o水平越低。见表3。

表3 各组患者的肝功能指标比较 （±s）

表3 各组患者的肝功能指标比较 （±s）

Gl o/（g/L）轻度乙肝组（n=47） 49.22±6.12 41.28±5.35 13.27±1.75 25.36±3.48中度乙肝组（n=51）109.37±18.39 83.26±9.47 32.48±4.37 18.21±2.11重度乙肝组（n=20）398.27±49.72 118.46±15.49 54.28±7.11 7.39±0.92对照组（n=142） 15.93±2.09 19.27±3.28 6.47±0.85 35.21±4.94组别ALT/（IU/L）TBIL/（μm ol/L）Al b/（g/L）F值 13.283 9.371 7.366 8.328 P值 0.011 0.014 0.019 0.017

2.4 Th17细胞表面趋化因子受体表达量与慢性乙肝病情的相关性

经相关分析发现，慢性乙型肝炎患者的Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达水平与H A、LN、Ⅳc、PCⅢ、ALT、Al b、TBIL呈正相关，与Gl o呈负相关（P＜0.05）。

3 讨论

乙肝病毒是一种非细胞毒性病毒，不直接参与肝细胞的破坏，但是其在肝细胞免疫病理损伤中发挥重要作用。肝组织中被激活的淋巴细胞可以表达特定的受体分子，受相应趋化因子吸引招募并定向迁移至靶器官，产生免疫应答及炎症反应[2]。最新研究显示，Th17细胞在慢性乙型肝炎患者的外周血及肝组织中均呈高表达，被认为是慢性乙肝的肝损伤直接相关。CCR4、CCR6、CXCR3是Th17细胞产生的3种主要趋化因子受体，在炎症过程中趋化因子与受体上的G蛋白发生偶联，引起炎症细胞的迁移及活化，最终触发三磷酸肌醇形成、胞内钙离子释放、蛋白激酶C激活等一系列细胞级联反应[3-4]。Th17细胞产生的一系列趋化因子受体是炎症细胞边集、附壁、定向移动到达炎症部位并攻击靶细胞的基础，其直接参与肝细胞的破坏及肝功能的损伤，在慢性乙型肝炎病情发展过程中发挥核心作用[5]。

为明确慢性乙型肝炎患者中Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达情况，本研究分别选择不同严重程度的慢性乙肝患者及健康体检者作为观察对象，采用流式细胞仪检测所有研究对象的外周血Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达水平。慢性乙型肝炎患者的外周血Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达水平较高，且随着病情加重CCR4、CCR6、CXCR3表达量增加[6-7]。该结果说明在慢性乙型肝炎患者中确实存在Th17细胞表面趋化因子受体的高表达，且在病情加重时上述趋化因子受体表达量进一步增加，说明在慢性乙肝患者中炎症因子的产生以趋化因子受体为依托发挥作用，且趋化因子受体的表达增加是导致慢性乙肝病情加重的重要内在原因之一。

肝纤维化是慢性乙型肝炎进展至肝硬化的必经阶段，是机体对各种损伤刺激进行修复的动态过程，由细胞外基质产生及降解失平衡所致[8]。早期代偿良好的慢性乙肝患者纤维化进程不明显，当乙肝病毒活性较强或者患者体质虚弱、病情进一步加重时，肝炎病情持续向肝硬化发展、机体内相关纤维化指标发生明显改变。本研究发现，慢性乙肝患者H A、LN、Ⅳc、PCⅢ水平较正常人有不同程度上升，说明乙肝病毒对肝细胞的损伤可以导致其在疾病不同阶段均产生纤维化趋势，而随着病情加重慢性乙肝患者的血清H A、LN、Ⅳc、PCⅢ水平进一步上升，提示在肝细胞持续损伤并进入失代偿状态时肝脏纤维化活跃、是患者病情恶化的直观标志[9-10]。除纤维化指标外，在慢性乙肝患者中肝功能是判断病情严重程度及预后的最常用指标，ALT、TBIL、Al b及Gl o是临床最常见的肝功能指标，其波动可以代表患者病情及后续走势[11]。本研究中，慢性乙肝患者的ALT、TBIL、Al b、Gl o水平较对照组发生明显改变，随着乙肝病情进展ALT、TBIL、Al b水平上升，Gl o水平下降。上述慢性乙肝患者的肝纤维化及肝功能指标值变化趋势与Th17细胞表面趋化因子受体表达变化一致，两者之间的相关性需进一步检测确定。

本研究中最后采用一元线性回归分析法对慢性乙肝患者外周血Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达量与肝纤维、肝功能指标值进行相关性分析，结果发现CCR4、CCR6、CXCR3表达量与H A、LN、Ⅳc、PCⅢ、ALT、TBIL、Al b、Gl o直接相关。至此，笔者已经发现Th17细胞表面趋化因子受体表达量增加直接导致慢性乙肝患者病情进展，而慢性乙肝患者体内炎症相关趋化因子的增加将进一步导致趋化因子受体表达量上升，形成恶性循环[12-13]。尽管笔者得到上述相关性结果，但是相关性分析仅仅说明两指标间的相关关系，无法证明已过关系，外周血Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达量是否直接影响肝纤维、肝功能，仍需体外研究及动物研究来进一步证实。

综上所述，慢性乙肝患者外周血Th17细胞表面CCR4、CCR6、CXCR3表达量与病情直接相关，可以作为疾病治疗的新靶点之一，有望打破目前慢性乙肝治疗的僵局，具有积极的临床意义。

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（童颖丹 编辑）

Value of CCR4,CCR6 and CXCR3 expressions on peripheral blood Th17 cell surface in assessment of disease condition in chronic hepatitis B patients*

Li-hua Sun,Bin Zhu,Yan-cai Zhou,Guang-wen Zhang
(Department of Infectious Diseases,the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College,Xinxiang,Henan 453100,China)

ObjectiveTo analyze the detective value of peripheral blood Th17 cell surface CCR4,CCR6 and CXCR3 expressions in assessment of disease condition in chronic hepatitis B patients.MethodsTotally 118 cases of hepatitis B patients in our hospital between August 2013 and December 2015 were chosen as observation group,142 people having health examination in our hospital at same period as control group. CCR4,CCR6 and CXCR3 expression levels on peripheral blood Th17 cell surface,serum fibrosis markers and liver function indexes were compared between the two groups.The relationships of CCR4,CCR6 and CXCR3 expressions with disease severity were further analyzed.ResultsTh17 cell surface CCR4,CCR6 and CXCR3 expression levels in peripheral blood,serum HA,LN,collagenⅣ,PCⅢ,ALT,Alb and TBIL values in the observation group were higher than those in the control group,while Glo value was lower than that in the control group (P＜0.05);these changes became more obvious along with exacerbation of chronic hepatitis B. CCR4,CCR6 and CXCR3 expressions in peripheral blood of the patients with chronic hepatitis B were posi－tively correlated with HA,LN,collagenⅣ,PCⅢ,ALT,Alb and TBIL values,but negatively correlated with Glo value(P＜0.05).ConclusionsIn chronic hepatitis B patients,Th17 cell surface CCR4,CCR6 and CXCR3 are abnormally expressed,and have direct correlations with severity of patients'condition.They can be used as new targets for the treatment of hepatitis B.

chronic hepatitis B;Th17 cell;condition assessment

1005-8982（2017）03-0069-05

R 512.62

A

2016-04-05

2013年度河南省医学科技攻关计划（No：201303107）