关岭牛Y染色体遗传多样性与父系起源研究

夏小婷，邹 勇，党瑞华，黄永震，蓝贤勇，陈 宏，雷初朝*

(1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100；2. 贵州关岭自治县动物疫病预防控制中心，贵州关岭，561300)

[目的]探究关岭牛Y染色体遗传多样性及父系起源。[方法] 采用PCR扩增、限制性酶切和生物信息学方法，分析关岭牛Y-SNP (USP9Y基因)和2个Y-STRs标记(INRA189和BM861)的遗传多样性。[结果] 发现32头关岭牛USP9Y基因的PCR产物均为552 bp，其中4头牛的552 bp片段不能被SspI酶切开，属于普通牛Y2单倍型组，占0.125，其余28头牛的PCR产物均可被酶切成两条带(215 bp和338 bp)，属于瘤牛Y3单倍型组，占0.875。2个Y-STRs标记INRA189和BM861在关岭牛品种均表现多态性(88/104 bp和156/158 bp)。结合Y-SNP与Y-STRs的分型结果，界定关岭牛有2种Y染色体单倍型Y2-104-158和Y3-88-156，其Y染色体单倍型多样度为0.2258±0.0882，表明关岭牛父系遗传多样性很低。[结论] 关岭牛具有普通牛Y2和瘤牛Y3 两种父系起源，其中瘤牛占明显优势。

关岭牛；USP9Y；Y-STRs；遗传多样性；父系起源

关岭牛是我国优良的地方黄牛品种之一，产于海拔800-1 500 m的贵州高原，因中心产区在贵州省关岭县，故按历史习惯将其统称“关岭牛”。关岭牛作为役肉兼用型地方黄牛品种，以体质健壮、肉质良好、耐粗饲、适应性强而著称[1]。目前，关于关岭牛品种的遗传多样性及遗传背景的研究较少。基于常染色体微卫星标记，韩旭等[2]对关岭牛等11个中外黄牛品种进行群体遗传学分析，探究了各品种间的遗传变异与亲缘关系，表明关岭牛与分布在云南省昭通地区的昭通牛遗传关系非常近，应聚为一类。在线粒体水平上，刘若余等[3]对22头关岭牛线粒体DNA D-loop区全序列进行分析表明，关岭牛同时受到普通牛和瘤牛的影响，遗传多样性丰富。

哺乳动物的Y染色体遵循父系遗传，其绝大部分为非重组区，突变率低，是研究动物父系起源和驯化历史的理想工具。近年来，基于Y染色体单核苷酸多态性(Y-SNPs)和微卫星(Y-STRs)的分子遗传研究，人们发现世界上的家牛具有Y1、Y2和Y3三种Y染色体单倍型组，其中Y1和Y2代表普通牛起源，Y3代表瘤牛起源[4，5]，2种分子标记的结合使用能够更精细地反映家牛Y染色体的起源历史[6, 7]。Bonfiglio等[5]发现，通过USP9Y基因内含子26上的一个81 bp的插入和一个限制性酶切位点进行琼脂糖电泳能够直接对这3种单倍型组进行分型后，不用测序只需PCR和酶切电泳分析就可以鉴别不同的单倍型组，这大大降低了分型成本和工作量。

然而，目前关于关岭牛品种Y染色体遗传多样性及父系起源的研究较少。因此，本研究对32头关岭牛Y染色体USP9Y基因和2个Y-STRs标记(INRA189和BM861)进行单倍型分析及父系起源研究，为开展该品种的分子育种和资源保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集与基因组DNA提取

从贵州省关岭县采集32头关岭牛公牛耳组织于-80℃保存备用。采用基因组DNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取基因组DNA，-20℃保存备用。

1.2 引物合成和PCR扩增

1.2.1USP9Y基因的合成、PCR扩增与酶切分析 参照Bonfiglio等[5]发表的家牛Y染色体USP9Y基因序列合成引物，其中上游引物为5′-AAACCCTTCAAGGTAATAAAACAAAA-3′，下游引物为5′- CACAGCTCCTCAAAACCAGA-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系为12.5 μL：上、下游引物各0.25 μL (10 pmol·L-1)，2×Taq MasterMix 6.25 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 5.25 μL。扩增条件为：95℃预变性4 min；94℃变性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸30 s，36个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

用2%的琼脂糖凝胶对USP9Y基因PCR产物进行电泳检测，根据扩增条带对单倍型组做出初步分析。再用SspI限制性内切酶对PCR产物进行酶切。SspI酶切体系为(8 μL)：SspI酶(10 units/μL)0.4 μL(TaKaRa公司)，10×SspI Buffer 0.8 μL，PCR产物2.4 μL，ddH2O 4.4 μL。置于37℃条件下酶切2～3 h后，用1%琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳检测，再根据条带大小进行单倍型分析和统计。

1.2.2 荧光微卫星引物的合成与PCR扩增 参照Edwards等[7]报道的分型方法合成2对荧光Y-STRs引物(INRA189[8]和BM861[9])，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系为12.5 μL，其中上、下游引物各0.25 μL (10 pmol·L-1)，2×Taq MasterMix 6.25 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 5.25 μL。扩增条件为：95℃预变性4 min；94℃变性30 s，Ta℃退火30 s，72℃延伸30 s，36个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。采用2.0%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物，将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司分型。

1.3 数据统计分析

通过单倍型组的判定结果和2个Y-STRs基因座的定型结果[7]，利用二者的结合定义每头黄牛的Y染色体单倍型(Y-INRA189-BM861)。用ARLEQUIN V3.11[10]软件计算单倍型频率和单倍型多样度(H±SD)。

2 结果与分析

2.1 关岭牛USP9Y基因PCR产物多态性与SspI酶切鉴定

通过对关岭牛USP9Y基因的PCR产物进行电泳检测，结果表明：32头关岭牛PCR产物大小均为552 bp，其中4个个体不能被SspI酶切开，有28个个体可以被酶切成215 bp和338 bp两条带(图1)。根据Bonfiglio等[5]的判定标准：Y1单倍型组(471 bp)能够直接通过琼脂糖凝胶电泳与Y2和Y3单倍型组区分开；利用SspI内切酶，Y3单倍型组(552 bp)可被切成215 bp和338 bp两条带，而Y2单倍型组(552 bp)不能被切开。因此，可以确定这4头不能被SspI酶切开的关岭牛(552 bp)为普通牛Y2单倍型组，另外28头能被SspI酶切成两条带(215 bp和338 bp)的关岭牛为瘤牛Y3单倍型组。

图1 关岭牛USP9Y基因PCR产物酶切多态性

2.2 关岭牛Y-STRs多态性

利用2个家牛Y-STRs标记INRA189和BM861检测关岭牛32头公牛的Y染色体遗传多态性，结果表明，2个标记在32头关岭牛中各检测到2个等位基因，表现出明显的多态性。在INRA189座位中，关岭牛的2个等位基因大小分别为88 bp和104 bp，其中Y2单倍型组对应104 bp，Y3单倍型组对应88 bp。在BM861座位中检测到关岭牛的2个等位基因大小分别为158 bp和156 bp，其中4头普通牛检测出的等位基因大小为158 bp，28头瘤牛检测出的等位基因大小为156 bp。

2.3 关岭牛单倍型频率和单倍型多样度

参考Edwards等[7]报道的Y-SNPs标记与Y-STRs标记结合的单倍型分型方法，对32头关岭牛的单倍型进行分析(Y-INRA189-BM861)，共确定了2种单倍型，其中4头牛为普通牛Y2单倍型(Y2-104-158)，28头牛为瘤牛Y3单倍型(Y3-88-156)，Y2和Y3单倍型频率分别为0.125和0.875，关岭牛Y染色体单倍型多样度为0.2258±0.0882。

3 讨论

Y染色体分子遗传多态性是追溯动物起源、驯化历史和迁徙路线的重要工具，通过对Y-SNPs与Y-STRs 2种分子标记的结合分析，能更完整、更精细地反映动物的Y染色体单倍型多样度和父系起源。近年来，国内外越来越多的研究已经将二者结合起来分析黄牛群体的Y染色体单倍型结构和父系起源历史[7, 11]，然而迄今为止，尚未见对关岭牛这一优良中国地方黄牛品种分子水平上的父系遗传多样性及起源的报道。

家牛有3种Y染色体单倍型组，分别是普通牛Y1和Y2单倍型组，瘤牛Y3单倍型组[4-7]。在世界现存的普通牛种中，Y1单倍型组在欧亚大陆北部分布广泛，Y2单倍型组主要集中于中东和欧洲南部[4]，而中国黄牛除少数品种含Y1单倍型组外[11，12]，大部分是Y2和Y3两种单倍型组[11]。本研究采用Bonfiglio等[5]发展的Y染色体USP9Y基因多态性检测技术，对32头关岭牛公牛进行了单倍型组分析，该方法与传统Y-SNPs测序分析相比快速有效，能显著降低分型成本。结果表明，4头关岭牛为普通牛Y2单倍型组，28头为瘤牛Y3单倍型组，说明关岭牛有普通牛(Y2)和瘤牛(Y3)两大父系起源，且瘤牛血统占优势。同时，本研究还采用Edwards等[7]报道的Y-SNPs标记与Y-STRs标记结合的单倍型分型方法(Y-INRA189-BM861)，共定义出关岭牛的2种Y染色体单倍型，其中Y3-88-156瘤牛单倍型明显占优势(0.875)，这与Li等[11]对中国部分黄牛品种的研究结果一致，说明关岭牛具有与中国南部黄牛品种相似的父系遗传组成，即以Y3-88-156瘤牛单倍型为主。另外，也与刘若余等[3]基于线粒体DNA D-loop区对关岭牛母系起源的研究结果相吻合。

单倍型多样度是衡量一个群体变异程度的重要指标，单倍型多样度高的群体说明其遗传多样性高，遗传资源丰富。值得注意的是，Edwards等[7]报道的138个国外牛品种的单倍型多样度平均值为0.422±0.3，Li等[11]公布的中国16个黄牛品种的单倍型多样度平均值为0.6831±0.0134，均大于本研究中32头关岭牛的单倍型多样度(0.2258±0.0882)，这表明关岭牛Y染色体单倍型多样度和分子遗传多样性较低，这可能与采样地区的公牛有效群体较小有关。据2011年《中国畜禽遗传资源志—牛志》[2]记载，关岭牛基本采取本交方式进行纯种繁殖，尚未建立关岭牛保护区和保种场。近年来，为了提高关岭牛的生产性能，引入了国外西门塔尔、利木赞、安格斯等肉牛品种冻精进行杂交改良，忽视了品种资源的保护，加之农户对种质资源保护的意识淡薄，近亲繁殖现象很普遍，导致关岭牛的优良性状正逐渐退化[13]。因此，必须加大对关岭牛保种的力度，建立健全的保种体系，从而使这一优良地方黄牛品种资源得到更有效的保护和利用。

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