家蚕氨肽酶 (BmAPN5) 与黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体 (PC) 毒素相互作用

付剑锋，林平，冯铁山，程冬，张权，夏庆友，程廷才

西南大学 家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400715

家蚕氨肽酶 (BmAPN5) 与黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体 (PC) 毒素相互作用

付剑锋，林平，冯铁山，程冬，张权，夏庆友，程廷才

西南大学 家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400715

氨肽酶N (APN) 属于锌金属肽酶M1 (Peptidase_M1) 家族的成员，不仅参与蛋白水解过程，而且也作为毒素受体参与病原微生物的致病过程。家蚕氨肽酶家族含有16个成员，其中BmAPN4结合黑胸败血芽孢杆菌产生的伴孢晶体 (PC) 毒素，为研究该基因家族其他成员是否与PC毒素结合，参与其致病过程。本文克隆家蚕中肠特异表达的氨肽酶家族成员BmAPN5基因，全长3 313 bp，编码953个氨基酸，含有1个锌金属肽酶M1和ERAP1_C结构域。构建原核表达载体，表达和纯化获得可溶性GST-BmAPN5重组蛋白。Far-Western blotting、免疫共沉淀和ELISA等实验结果表明BmAPN5和活化的PC毒素相互结合。通过构建BmAPN5细胞转染载体，转染Sf9细胞系，与PC毒素共孵育，导致细胞形态改变和裂解死亡；同时，乳酸脱氢酶含量测定结果 (LDH) 表明BmAPN5参与PC毒素致病过程，导致细胞裂解死亡，使细胞培养基中的乳酸脱氢酶升高。上述结果表明BmAPN5作为一种功能性受体，PC毒素与其相互作用，参与了病原物的致病过程，为进一步揭示病原微生物黑胸败血芽孢杆菌与宿主相互作用的致病机制研究奠定了基础。

家蚕，黑胸败血芽孢杆菌，氨肽酶，PC毒素，相互作用

氨肽酶N (APN) 属于锌金属肽酶M1成员，具有从 N端水解蛋白质或寡肽的活性[1]。在鳞翅目昆虫中肠刷状缘膜上的APN不仅参与蛋白水解过程，也是病原毒素的重要受体之一。昆虫中肠刷状缘膜上的APN含量丰富，结合苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis, Bt) 伴孢晶体毒素 (Cry)，参与其致病过程[2]。Bt Cry与APN受体特异结合后，毒素插入细胞膜形成孔洞，导致膜电压和离子平衡改变，破坏细胞，从而在中肠形成孔洞，细菌及其毒素通过孔洞进入血淋巴，最终导致昆虫死亡[3–4]。

家蚕 Bombyx mori作为典型的鳞翅目模式昆虫，已被广泛应用于鳞翅目昆虫与病原微生物相互作用研究，尤其是Bt毒素的致病机理研究。家蚕基因组含有 16个 APN基因，分为 3个亚家族，11个APN基因具有表达活性，其中有7个BmAPN在中肠特异表达或高量表达[5]。目前，在家蚕中已报道4个APN蛋白与Bt的Cry毒素的致病性相关，其中，BmAPN1可结合Cry1Aa和Cry1Ab蛋白[6–7]。BmAPN2-4分子量介于90-110 kDa之间，它们不直接与Cry1Aa相互作用[8]，而位于中肠刷状缘膜上的BmAPN3可与Cry1Ac相互作用，参与其致病过程[9]。由此可见，并非所有家蚕APNs都可以与Bt的不同类型的Cry直接作用。

黑胸败血芽孢杆菌 (Bacillus bombysepticus, Bb) 与Bt同属芽孢杆菌属，是家蚕细菌性败血病的常见病原之一。类似Bt的致病机制，Bb在形成芽孢的过程中，同样产生伴孢晶体毒素蛋白 (PC)，引发家蚕细菌性败血症[10]。基因表达谱芯片结果显示9个APN基因诱导表达，例如BmAPN1、BmAPN2和 BmAPN4等[10]。其中，活化的PC毒素对表达BmAPN4蛋白的昆虫细胞具有强烈的毒性，揭示了BmAPN4作为功能性受体参与 PC毒素的致病过程[11]。在此基础上，本研究采用基因克隆、构建重组蛋白表达载体和转染质粒、分离纯化Bb伴孢晶体PC毒素、Far-Western blotting、免疫共沉淀 (Co-IP)、酶联免疫吸附 (ELISA) 和免疫荧光等方法，研究BmAPN5受体是否与胰蛋白酶活化的PC毒素相互作用，为进一步完善家蚕病原菌Bb的致病机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Bb菌株和 Sf9细胞系由本实验室保存。pMD19-T Simple和 pSL1180质粒载体购于TaKaRa。pGEX-4T-1表达系统、GSTrapFF纯化柱购于 GE。转染试剂 Cellfectin®Ⅱ Reagent购于Invitrogen。Bradford蛋白质定量试剂盒、LDH Cytotoxicity Assay Kit购于碧云天。anti-GST和anti-Tubulin购于Sigma。HRP标记羊抗兔二抗为北京中衫金桥产品。

1.2 方法

1.2.1 PC毒素纯化和活化

PC毒素从Bb菌株分离获得，并进行胰蛋白酶处理活化毒素蛋白，具体方法参考林平等[11]研究。将Bb菌株接种于含有5 mL LB液体培养基 (胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH 7.2)，30 ℃摇床培养，从34 h开始取样，油镜观察到伴孢晶体和芽孢产生后，将菌液于4 ℃、7 000 r/min离心15 min，用预冷的NaCl溶液洗涤，以除去培养基中的杂蛋白。沉淀中加入 100 mL裂解液 (50 mmol/L Na2CO3，25 mmol/L EDTA，5%巯基乙醇)，冰浴轻摇过夜。离心收集上清，加入7 mL 4 mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液 (pH 4.5)，静置于冰上4 h，使蛋白完全沉淀；离心收集沉淀，将所得的沉淀在4 ℃下溶于50 mmol/L Na2CO3(pH 9.5)，搅拌至完全溶解，测定纯化获得 PC蛋白浓度。将纯化的PC蛋白与胰蛋白酶以质量比为 25∶1混合，37 ℃温育6 h，加入1/10体积4 mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液 (pH 4.5)，4 ℃静置15 min，12 000 r/min离心 10 min，收集沉淀，加入双蒸水振荡溶解，重复该步骤 3次。最后用 50 mmol/L Na2CO3(pH 10.0) 溶解沉淀，得到活化的PC毒素蛋白。

1.2.2 BmAPN5重组表达和纯化

根据 BmAPN5基因 (SilkDB基因编号：BGIBMGA008062) 和表达序列标签信息，以家蚕中肠cDNA为模板，克隆BmAPN5编码区序列，与pMD19-T Simple载体连接，阳性克隆进行测序验证。用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收BmAPN5酶切片段。同时，用 Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切 pGEX-4T-1原核表达载体，获得pGEX-4T-1载体酶切片段，BmAPN5酶切片段和pGEX-4T-1酶切片段进行连接转化，筛选阳性克隆，获得pGEX-4T-1[GST-BmAPN5]重组质粒载体；重组质粒 pGEX-4T-1[GST-BmAPN5]转化大肠杆菌BL21感受态细胞，加入 IPTG 至终浓度为0.2 mmol/L后在 37 ℃条件下培养 4 h，进行BmAPN5蛋白诱导表达，采用 GSTrapFF (GE Healthcare) 纯化重组蛋白，进行SDS-PAGE电泳检测和Western blotting分析。

1.2.3 转染载体构建和细胞毒理实验

以pSL1180载体为骨架质粒，将BmAPN5构建为pSL1180[hr3-BmAct4-BmAPN5-SV40]转染质粒，采用Cellfectin Ⅱ试剂(Invitrogen)转染Sf9细胞，实验操作流程参考Cellfectin II试剂的说明书 (Protocol Pub. No. MAN0007821)；转染48 h后，收集细胞，分别提取总RNA和蛋白质，采用RT-PCR和Western blotting方法检测BmAPN5基因和蛋白表达水平。收集转染48 h细胞，PBS洗涤3次，加入PC毒素，至浓度为50 μg/mL，孵育6 h后，显微观察Sf9细胞生长情况，统计相同放大倍数下的细胞个数。乳酸脱氢酶 (LDH) 细胞毒性检测使用 LDH Cytotoxicity Assay Kit (碧云天)，参照标准实验步骤，测定LDH活性。

1.2.4 Far-Western blotting

Far-Western blotting参照标准流程[12–13]，SDS-PAGE电泳分离活化的PC毒素蛋白，打开转膜板，依次放入海绵、滤纸、蛋白胶、PVDF膜、滤纸、海绵，放于4 ℃冰箱中，恒压100 V转移1 h；5% BSA的TBST室温封闭2 h；TBST洗 3次，每次 5 min；加入纯化获得的GST-BmAPN5重组蛋白液，4 ℃孵育过夜；TBST洗3次，每次5 min；加入anti-GST抗体(1∶8 000)，室温孵育1 h；TBST洗3次，每次5 min；加入碱性磷酸酶标记的山羊抗兔的二抗(1∶10 000)，室温孵育1 h；TBST洗涤3次；用ECL显色试剂进行显色反应。

1.2.5 免疫共沉淀 (Co-IP)

将100 μg蛋白与相应的抗体在室温下孵育1 h，然后在室温条件下与 Protein A megnetic bead (Thermo Fisher Scientific) 孵育1 h，之后用BS3 (Thermo Fisher Scientific) 进行交联，洗涤5次，再与PC毒素4 ℃孵育过夜，洗涤5次后进行洗脱。

1.2.6 酶联免疫吸附 (ELISA)

ELISA实验流程参照Pacheco等[3]方法，将1 μg纯化的重组蛋白 BmAPN5置于 100 mL PBS/孔板，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，加入200 μL PBS-M，37 ℃封闭2 h，PBS洗涤3次，加入0.1 nmol/L活化 PC毒素，加入anti-GST抗体和二抗，450 nm 检测，GraphPad Prism (version 5.0b) 软件用于数据分析。

1.2.7 免疫荧光

将载玻片置于12孔板中，加入Sf9 细胞后经Cellfectin II试剂转染48 h，PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定 5 min，PBS冲洗 3次，加5%BSA封闭液室温封闭2 h，加BmAPN5一抗稀释液 (1∶1 000)，室温孵育1 h，PBS冲洗3次，荧光标记二抗 (1∶500) 稀释液于室温孵育1 h，PBS冲洗3次，显微观察。

2 结果与分析

2.1 BmAPN5重组表达和纯化

BmAPN5基因全长3 313 bp，包括16个外显子和15个内含子，ORF全长2 862 bp，起始密码ATG位于第二外显子上，终止密码TAG位于第16外显子，共编码953个氨基酸，含有一个保守的锌金属肽酶 M1和 ERAP1_C结构域(图1A)。BmANP5基因在中肠特异高量表达[5]，将该基因的编码序列克隆到pGEX-4T-1载体，构建带有 GST标签的 APN5重组表达载体(图1B)。转化大肠杆菌BL21菌株，在37 °C诱导的条件下以可溶形式表达，采用GSTrapFF纯化重组蛋白，获得GST-BmAPN5重组表达蛋白(图1C)。

2.2 PC毒素与BmAPN5相互作用

为了研究PC毒素与BmAPN5是否存在相互作用的关系，参考林平等[11]的研究，从 Bb菌株中分离纯化得到了PC毒素，并用胰蛋白酶消化获得活性毒素。采用far-Western blotting方法，将活性PC毒素蛋白转移至PVDF膜，加入纯化获得的GST-BmAPN5重组表达蛋白，过夜孵育，其中 GST标签蛋白和牛血清蛋白 (BSA) 作为阴性对照；结果显示PC与GST-BmAPN5相结合 (图2A)。同时，采用Co-IP方法，将重组蛋白GST-BmAPN5、GST抗体孵育，再与磁珠孵育后，加入活性PC毒素孵育过夜，洗脱蛋白，SDS-PAGE电泳检查，结果显示 PC毒素与BmAPN5结合(图2B)。采用ELISA方法，将活性PC与BmAPN5进行孵育，在450 nm吸收光值检查发现，BmAPN5吸收光值显著高于对照(P<0.01，图2C)。综合上述far-Western blotting、Co-IP和ELISA三个实验结果，表明BmAPN5与PC毒素存在相互作用。

图1 BmAPN5基因结构 (A)、表达载体构建 (B) 和重组蛋白表达纯化 (C)Fig. 1 Gene structure of BmAPN5 (A) and in vitro expression vector (B) and purification of GST-BmAPN5 recombinant protein (C). 1: molecular marker; 2: GST-BmAPN5 recombinant protein.

2.3 Sf9细胞表达BmAPN5

为了进一步验证BmAPN5是否参与PC毒素的致病过程，首先，构建转染质粒载体pSL1180[hr3-BmAPN5-SV40] (图 3A)，转染 Sf9细胞48 h后，提取细胞总RNA和总蛋白，分别采用RT-PCR和Western blotting方法，检测BmAPN5的表达情况，结果显示，BmAPN5在Sf9细胞中稳定表达 (图 3B)。采用免疫荧光定位，荧光信号主要位于细胞质和细胞膜 (图 3C)，结果表明Sf9细胞系表达的BmAPN5能定位于细胞膜。

图2 BmAPN5与胰蛋白酶活化的PC毒素相互作用Fig. 2 Binding assays for trypsin-activated PC with BmAPN5. (A) Far-Western blotting analysis of trypsin-activated PC and BmAPN5. (B) A Co-IP assay for trypsin-activated PC and BmAPN5. (C) ELISA binding saturation assays of trypsin-activated PC and BmAPN5. Error bars x±s. Statistically significant differences from the control samples are indicated; **P<0.01.

图3 BmAPN5在Sf9细胞表达和定位Fig. 3 Expression and location of BmAPN5 in Sf9 cell line. (A) Structures of transient expressing vector. (B) RT-PCR and Western blotting analysis of BmAPN5 in a Sf9 cell line. (C) Immunocytochemical analysis of BmAPN5 in Sf9 cells. Signals for Sf9 cells and BmAPN5 were detected under blue and red fluorescence.

2.4 BmAPN5参与PC毒素致病过程

为了验证BmAPN5参与PC毒素的致病过程，在细胞水平进行PC毒素毒理学实验。设置3个阴性实验对照组：Sf9细胞 (图4Aa)、转染BmAPN5但没有与PC毒素孵育 (图4Ab)、Sf9细胞与PC毒素孵育 (图4 Ac)，结果显示细胞形态和细胞数目并未发生明显变化。在实验组中，PC毒素与转染了BmAPN5的Sf9细胞孵育，结果显示Sf9细胞形态改变、细胞裂解死亡和细胞数量显著减少 (图4Ad和4B)。根据细胞培养基中乳酸脱氢酶含量与细胞死亡数目成正比的原理，测定实验组中的乳酸脱氢酶 (LDH) 活性，PC毒素导致转染BmAPN5的细胞培养基中的乳酸脱氢酶的含量显著高于对照 (图 4C)，暗示BmAPN5参与PC毒素蛋白致病过程，导致细胞裂解死亡，从而使细胞质中的LDH释放到培养基中。

3 讨论

图4 细胞水平检测PC毒素蛋白的作用Fig. 4 Cytotoxic activity of trypsin-activated PC-induced BmAPN5-expressing Sf9 cells death. (A) The cytotoxic activity of trypsin-activated PC proteins on Sf9 cells transfected with the gene encoding the BmAPN5. Photomicrographs of healthy uninfected cells. (B) The number of cells with such alterations after PC-treated healthy and BmAPN5-expressing Sf9 cells is shown. (C) Trypsin-activated PC-induced cell death was measured based on the extracellular release of LDH activity after incubation for 6 h. Error bars x±s. Statistically significant differences from the control samples are indicated. **P<0.01.

细菌合成分泌的毒素是其致病的毒力因子[14]。细菌毒素通过与宿主细胞的受体蛋白相结合，使毒素蛋白发生低聚反应，形成多聚体，插入细胞膜上导致细胞穿孔，导致细胞裂解死亡[15]。在本文中，我们克隆BmAPN5基因，重组表达并纯化获得 GST-BmAPN5蛋白。通过 far-Western blotting、Co-IP和 ELISA证明了 BmAPN5与PC毒素存在相互作用。同时，细胞毒理实验证实了BmAPN5作为一种功能性受体，参与PC毒素对Sf9细胞的致病过程。

昆虫中肠是抵抗病原微生物入侵的第一道防线，能够触发多种免疫应答机制来抵抗病原菌的侵染。同时，在中肠细胞上也存在多种病原菌的受体，参与病原菌及其毒素的致病过程，这在病原菌的感染和疾病的发生过程中起着至关重要的作用[16]。昆虫中肠细胞含有丰富的APN，并且APN是通过GPI-anchor锚定在细胞膜上[17]。在家蚕中，7个APN基因在中肠特异表达或高量表达[5]。家蚕中肠刷状缘膜囊泡中存在许多可以与Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac结合的 APN异构体，这些异构体分子量在 93 kDa到110 kDa之间，分别是93 kDa、96 kDa、100 kDa、105 kDa和110 kDa，其中96 kDa的异构体只与Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac中的Cry1Ac结合[9]。细菌毒素既可与一个受体蛋白相互作用，也可以与多个受体蛋白相互作用[18–21]。在家蚕中，已有研究表明BmAPN4和BtR-175也可以与PC毒素相互作用[11]。BmAPN5与BmAPN4结构非常类似，且也可与PC毒素相互作用，参与毒素的致病过程。PC毒素和Bt类毒素通常都有低聚化过程[10]，绝大部分中肠刷状缘膜囊上含有丰富的多种 APN受体都可与毒素类蛋白相互作用，起到富集毒素蛋白而促进毒素蛋白发生低聚反应的作用。目前这仅是一种推测，还需进一步深入研究。

Bb感染家蚕幼虫后，电镜结果显示中肠上皮细胞产生PC毒素积累，上皮细胞受到破坏，形成大小不一的孔洞[10]，这类似于Bt毒素的致病过程[9]。Bt毒素的“pingpong”结合机制涉及毒素优先与含量丰富但亲和力低的APN结合，之后与含量少但亲和力高的钙粘蛋白结合[3]。在家蚕中，已报道受体APN和BtR-175与Bt毒素结合相关[22]，与BtR-175相结合后，单体Bt毒素发生低聚反应，形成预穿孔的低聚体结构，Bt低聚体与APN结合，插入膜上，形成孔洞导致宿主死亡[3]。结合先前家蚕APN4和BtR-175参与PC毒素致病机制的研究[11]，PC毒素被家蚕中肠蛋白酶消化形成有活性的单体毒素，穿过穿透围食膜，优先与中肠上皮细胞上含量丰富但亲和力低的多种APN受体结合，如APN4和APN5，之后与含量低但亲和力高的钙粘蛋白结合，使PC毒素蛋白构象发生改变，低聚反应形成预穿孔的低聚体。该低聚体插入膜上形成孔洞，导致膜电压和离子平衡改变，破坏细胞，从而在中肠形成孔洞，细菌及其毒素通过孔洞进入血淋巴，导致家蚕中毒性败血病，引起家蚕死亡[11]。由此可见，毒素与受体相结合是细菌毒素致病的关键步骤，就经济昆虫家蚕而言，可以通过基因组编辑技术对靶标受体遗传操作实现抗性素材创新。

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(本文责编 陈宏宇)

Interaction of aminopeptidase (BmAPN5) and parasporal crystal (PC) toxin isolated from Bacillus bombysepticus

Jianfeng Fu, Ping Lin, Tieshan Feng, Dong Cheng, Quan Zhang, Qingyou Xia, and Tingcai Cheng

State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400715, China

Aminopeptidase N (APN) belonging to zinc-dependent metalloproteinase, not only catalyzes protein proteolytic process, but also is involved in the pathogenic process as the receptor of pathogenic toxin. In Bombyx mori, APN gene family consists of 16 members, of which BmAPN4 binds trypsin-activated parasporal crystal (PC) toxin isolated from Bacillus bombysepticus (Bb). In order to verify whether or not other APNs interact with PC toxin during the pathogenesis of Bb, we cloned BmAPN5, a member of aminopeptidase family, from the silkworm midgut. The full length of BmAPN5 is 3313 bp, encoding 953 amino acids, containing a zinc peptidase_M1 and ERAP1_C domains. A recombinant GST-BmAPN5 was purified by a prokaryotic expression system. Far-Western blotting, co-immunoprecipitation and ELISA. Binding saturation assays demonstrated that PC after activated by trypsin could be bound by BmAPN5. Additionally, cytotoxic activity of trypsin-activated PC in Sf9 cells transfected with BmAPN5 showed that cells exhibited dramatic cytological changes, including swelling and lysis, revealing BmAPN5 serves as a functional receptor that participates in Bb and PC pathogenicity. These provide some clues for further exploring the pathogenesis relationships of Bb and host.

Bombyx mori, Bacillus bombysepticus, aminopeptidase, PC toxin, interaction

Tingcai Cheng. Tel: +86-23-6825187; Fax: +86-23-68251128; E-mail: chengtc@swu.edu.cn

10.13345/j.cjb.160211

Received: May 28, 2016; Accepted: July 22, 2016

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB114600), Natural Science Foundation of Chongqing (No. CSTC2014JCYJA80004).

国家重点基础研究发展计划 (973计划) (No. 2012CB114600)，重庆市科委自然科学基金 (No. CSTC2014JCYJA80004) 资助。

付剑锋, 林平, 冯铁山, 等. 家蚕氨肽酶 (BmAPN5) 与黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体 (PC) 毒素相互作用. 生物工程学报, 2017, 33(1): 90–98.

Fu JF, Lin P, Feng TS, et al. Interaction of aminopeptidase (BmAPN5) and parasporalcrystal (PC) toxin isolated from Bacillus bombysepticus. Chin J Biotech, 2017, 33(1): 90–98.