肿瘤细胞来源的外泌体在结直肠癌中的研究进展*

邬升超，郭玮，潘柏申

(复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032)

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肿瘤细胞来源的外泌体在结直肠癌中的研究进展*

邬升超，郭玮，潘柏申

(复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032)

外泌体(exosome)作为目前液体活检领域中研究的热点已被证实可参与多种生物学的过程。其所包含的大量核酸如DNA、RNA以及大分子如脂类和蛋白质等，均可以外泌体为载体通过控制微血管生成、调节基质细胞、重铸细胞外基质以及建立“预转移微环境”等多种途径，从而促进肿瘤的侵袭与转移。该文以肿瘤细胞来源的外泌体为主要对象，介绍外泌体及其分离技术，并对其在结直肠癌中的研究进展进行分析及论述。

结直肠癌；外泌体；细胞外囊泡；miRNAs；蛋白质

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)属于临床常见的恶性肿瘤，手术切除是最有效的治疗方式，但鉴于CRC起病隐匿，通常发现时已处于晚期，绝大部分患者由此失去最佳治疗时机。虽然传统化疗或者分子靶向治疗对于CRC患者部分有效，但最终均会受到诸如耐药和药物毒性等因素的影响，从而缩短了生存时间，生存质量也无法获得保障。因此深入理解CRC的发生与发展、靶向及化疗治疗耐药产生的机制，从中筛选出具有价值的标志物将有助于在预防、诊断、治疗和预后评估等环节中为临床决策提供参考。

早在20世纪80年代，外泌体(exosome)被用于指代来自于网织红细胞分化过程中由多囊核内体或者多囊小体与细胞膜融合后所形成的核内来源的小囊泡。后续的研究发现，这些由细胞分泌的囊泡被证明可参与生理以及病理过程，细胞外囊泡受到越来越多的关注。其中物理性质相对均一、分离技术成熟的外泌体，更是成为目前研究的热点。游离于外周血的外泌体不仅仅来自于肿瘤细胞、包括血小板、有核细胞、基质细胞等非肿瘤细胞均可分泌外泌体。目前针对外泌体的研究涵盖了包括乳腺癌、胰腺癌、肺癌和肝癌等常见癌种，不同来源的外泌体均被证实可参与到肿瘤微环境的调节、免疫调节以及耐药发生等多个领域[1-3]。同时外泌体还可被用作药物治疗的载体，有望成为一种全新的分子治疗手段[4-5]。本文将以“肿瘤细胞来源的外泌体”为主要叙述对象，对其在CRC中的相关研究成果进行分析及论述。

1 外泌体的形成、分类及主要内容物

细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)根据其直径大小从高到低依次分为凋亡小体(1～5 μm)、微囊泡(100 nm～1 μm)和外泌体(40～100 nm)。上述3类细胞外囊泡除了在大小上存在差异外，在形态、内容物、释放的机制等均各不相同，目前该领域研究最为广泛的是外泌体。外泌体在细胞中经过细胞膜内陷、多囊泡体(multivesicular body, MVB)形成、MVB与细胞膜的融合等步骤从供体细胞中分离。之后游离的外泌体通过与受体细胞质膜的融合、内吞或与细胞表面受体结合的方式进入受体细胞[6]。外泌体可通过将包含在其中的DNA、mRNA、miRNAs、短肽以及蛋白质等内容物释放入受体细胞，从而构建起供体与受体细胞之间的互相联系。来自肿瘤细胞的外泌体可特异性的表达膜表面蛋白质标志物，包括核内相关蛋白(如Rab家族GTP酶, 膜联蛋白和鞭毛蛋白)，与外泌体生物合成相关的蛋白质(如Alix、Tsg101和ESCRT复合物)，四分子交联体家族(如CD9、CD37、CD53、CD63、CD81h和CD82)，热休克蛋白(Hsp70和Hsp90)以及上皮细胞黏附分子(EpCam)。因此通过分析内容物中特定蛋白质或核酸的水平，采用基于质谱的分离或者包被有特定抗体的磁珠或者芯片对外泌体表面分子进行分选，可辅助肿瘤的诊断、为判断肿瘤原发位置提供依据[1,3,7-9]。

2 外泌体的分离和保存

目前常见的外泌体分离方法分为基于超速离心的实验室自建方法和非基于超速离心的商业化试剂两大类[10-11]。超速离心法是最为经典的外泌体分离方法，利用超速离心机通过多步离心可有效从血清/血浆中分离出外泌体。但实际应用中，由于该方法操作复杂、耗时且依赖特殊的仪器，一定程度上限制了其未来进入大规模临床应用的前景。相比较之下，目前市场上常见的商业化试剂盒通过免疫结合沉淀、磁珠法和聚乙二醇法[12]等成功规避上述问题，优化了操作步骤的同时所获取的外泌体质量并不逊于传统方法。Helwa等[13]的研究结果显示，对不同水平的起始样本量分别进行测试，无论以外泌体的大小分布情况、外泌体内RNA(mRNA和miRNAs)的产量和质量，还是表面蛋白质标志物的表达作为评估标准，商品化试剂盒对外泌体的分离性能均等同于超速离心法。

分离后的外泌体如果需要进行后续DNA或RNA的抽提，可根据需求选用对应的试剂盒。但外泌体的合理保存将直接影响到后续抽提工作最终获得的样本浓度。37 ℃环境下，使用超滤法或者超速离心法获得的外泌体约2 h就会发生降解并开始释放内容物[14]。文献报道，使用ExoQuick试剂盒进行抽提，最终获得的外泌体即使在-80 ℃的环境下仅可在18 h内维持稳定状态[15]。因此，对于外泌体的保存尽可能以最终目的模板的形式，如需完整的外泌体，高速离心法进行分离配合-80 ℃冻存可能是更好的选择。

3 外泌体在CRC中的应用

大量研究发现，肿瘤来源的外泌体可通过控制微血管生成、调节基质细胞、重铸细胞外基质以及建立“预转移微环境”等多种途径，从而促进肿瘤的侵袭与转移[16-18]。不仅仅限于肿瘤来源的外泌体，包括血小板、成纤维细胞以及基质细胞等非肿瘤细胞来源的外泌体，同样可进入肿瘤细胞释放内容物从而调节肿瘤的侵袭、耐药乃至改变肿瘤微环境中的免疫系统[19-21]。外泌体调控靶细胞主要通过包裹在磷脂双层内的内容物作用于靶标。进入细胞质后，外泌体释放出种类丰富的蛋白质、脂质、DNA和RNA(mRNA、miRNAs、circRNAs和lncRNAs等)。

3.1 CRC细胞来源外泌体所分泌的蛋白质 外泌体相关的蛋白质可根据来源分为两大类：外泌体特异性与亲代细胞特异性。肿瘤细胞分泌的外泌体中包含大量外泌体特异的蛋白质，包括：内体蛋白分选转运装置(ESCRT)、四分子交联体家族成员9(TM4SF9)、转运相关和细胞骨架相关蛋白质。由于外泌体是在细胞内进行装配合成，因此其中还囊括了大量亲代细胞的蛋白质。Mathivanan等[22]对CRC细胞系LIM1215的蛋白质组学分析，结果证实外泌体中包含的如A33、cadherin-17、CEA、上皮细胞表面抗原(EpCAM)、增殖细胞核心抗原和表皮生长因子受体等均为亲代细胞特异性。除了不同的亲代细胞类型，来自外界环境的刺激也会对细胞所分泌外泌体中蛋白质与miRNAs的水平和种类产生影响。Ragusa等[23]使用西妥昔单抗分别处理的Caco-2(西妥昔单抗敏感)和HCT-116(西妥昔单抗抵抗)CRC细胞系，结果出现了不同的miRNAs以及蛋白质谱。

对于实体肿瘤而言，肿瘤的异质性使得在肿瘤微环境中肿瘤细胞间以及肿瘤细胞与非肿瘤细胞间的沟通变得极为复杂，以外泌体为工具进行“交流”的方式可促进肿瘤细胞的迁移和侵袭能力[18,24-28]。Demory Beckler等[27]采用LC-MS/MS对结肠癌细胞DKs-8(野生型)、DKO-1(杂合突变型)和DLD-1(纯合突变型)所释放的外泌体进行蛋白质组学分析，携带有KRASG13D突变等位基因的外泌体的蛋白质组学结果与野生型存在明显差异。将DKO-1所分泌的外泌体与DKs-8共培养后，使用western blot可在DKs-8细胞中检测出KRASG13D突变短肽，同时体外实验也证实共培养后的DKs-8细胞的三维生长能力明显提升，提示在肿瘤微环境中不同细胞间可通过外泌体作为有效的“沟通”工具，增加肿瘤细胞的侵袭能力。Chen等[26]同样证明 CRC患者血清来源的外泌体在促进肿瘤侵袭性的过程中起到关键作用，但对肿瘤细胞的生存和增殖的影响是有限的。Ji等[18]采用OptiPrepTM密度梯度分离的方法获取外泌体后，使用 GeLC-MS/MS分析分别来自于原发(SW420)和转移(SW480)的人CRC细胞系来源的外泌体。结果显示来自于转移性CRC细胞的外泌体可选择性富集涉及转移相关的关键分子以及信号转导分子。同时在两种细胞系来源的外泌体内均可发现促进肿瘤生成的EPCAM-CLDN7复合物以及调节细胞骨架重塑的TNIK-RAP2A复合物。

肿瘤细胞同样可通过外泌体改变肿瘤微环境中的免疫细胞的表型，进而抑制免疫细胞的正常功能。对于许多恶性肿瘤患者，肿瘤微环境中或者外周血中CD4+Foxp3+调节性T细胞(Tregs细胞)数量的升高提示存在肿瘤免疫耐受的状态，预后较差。Yamada等[29]发现CRC细胞系来源的外泌体中高表达TGF-β1，而TGF-β1可促进Tregs细胞的产生。其认为正是TGF-β1激活TGF-β/Smad信号通路的同时沉默SAPK通路，导致T细胞向Treg样细胞的转变。

3.2 CRC细胞来源外泌体所分泌的miRNAs miRNAs是一类长约15～23 bp短单链RNA序列，现已知的mRNAs可调控50%以上可编码蛋白质的基因表达。miRNAs与靶mRNA 3′UTR特定区域的特异性结合，通过调节靶基因的转录水平从而起到对受体细胞生物调节的作用。异常表达的特定miRNAs可作为许多肿瘤的潜在的标志物应用于包括诊断、预后和疗效评估等领域。

游离在外周血中的大量miRNAs可来源于坏死的肿瘤和细胞，同样还包括不同类型的细胞所分泌的外泌体，有研究认为血清中miRNAs主要来源于外泌体。虽然目前无法完全阐明血清中miRNAs的主要来源，但是利用细胞系对外泌体中所包含miRNAs谱的分析将有助于理解肿瘤微环境中细胞间互相作用的机制。Ji等[30]使用第二代测序技术对来源于CRC细胞系LIM1863所分泌的细胞微囊泡和2个外泌体亚群(A33+和EpCAM+外泌体)中的miRNAs进行分析。结果显示上述每类微囊泡的miRNAs谱都是独特的，且根据细胞系不同miRNAs的分布情况也有不同。该结果同样在其他研究中被证实包括KRAS突变和药物治疗均会引起外泌体miRNAs谱的差异[23,31]。

肝转移是晚期CRC患者最常见的血行转移方式。其中15%～25% CRC患者于诊断时即可发现肝转移，另有15%～25%的患者将在原发灶根治术后发生肝转移，其中绝大多数肿瘤转移灶无法获得根治性切除，导致肝转移成为晚期结直肠癌患者的主要死因之一。因此理解CRC的转移机制，寻找合理的治疗靶点具有重大意义。2017年，Teng等[32]发现MVP可与miR-193a构成复合物，完成将miRNAs从肿瘤细胞装配入外泌体的过程。其通过研究证实在敲除MVP基因的结肠癌细胞中，具有肿瘤抑制作用的miR-193a在细胞内积聚，miR-193a以Caprin-1 mRNA为靶标通过抑制其蛋白质的合成，最终抑制肿瘤细胞的生长。可见具有选择性的外泌体miRNAs装配过程将影响肿瘤细胞的侵袭能力，作为介导miRNAs转运的核心MVP或许可成为一个全新的治疗靶点。Bigagli等[33]通过体外培养结肠癌细胞系HCT-8，发现包含有miR-210的外泌体可通过在原位维持肿瘤生长的自由环境从而促进EMT的发生，同时引导肿瘤细胞转移。

CRC外泌体miRNAs在临床的应用目前主要涉及诊断和预后判断领域。Ogatakawata等[34]使用微列阵分析血清中外泌体miRNAs谱，筛选得到包括let-7a、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223和miR-23a在内的7个miRNAs在CRC患者中的表达水平均明显高于健康人，且在5种常见CRC细胞系(HCT116、HT-29、RKO、SW48和SW480)验证中得到同样的结果，因此该miRNAs组合可应用于CRC的诊断。在Uratani等[35]的研究中，miR-21还可被用于区别结肠腺瘤患者与健康人。除了在诊断领域的应用，Matsumura等[36]发现来自血清外泌体的miR-19a可作为CRC患者疾病复发的预后指标。对于早期CRC患者(Ⅱ期和Ⅲ期)，miR-4772-3p同样可作为疾病复发的预后指标，且低miR-4772-3p水平的患者在接受FOLFOX辅助治疗后疾病的复发概率更高(9/10 vs 10/56,P<0.01)[37]，提示其还可能作为治疗反应的预测指标。

3.3 其他标志物 除miRNAs外，其他非编码RNA在外泌体中也有分布并认为可能参与到肿瘤相关的进程。LncRNAs是一类片段长度大于200个碱基且不具备编码蛋白质能力的RNA，在肿瘤的发生和抑制肿瘤的过程中均扮演重要角色，因此肿瘤细胞中异常表达的lncRNAs可作为诊断和预后的标志物。Liu等[38]发现外泌体lncRNAs CRNDE-h的水平与区域性淋巴结转移以及远处转移明显相关，用于诊断CRC的性能优于CEA，同时还可作为预后判断标志物。另外,Dong等[39]通过筛选多类型标志物后获得的组合包括了2个mRNAs(KRTAP5-4和MAGEA3)与1个 lncRNAs(BCAR4)，可用于诊断CRC。值得一提的是在该研究中还对不同类型的细胞外囊泡中lncRNAs的类型进行比较，发现外泌体对于lncRNAs的富集作用要明显优于凋亡小体和微囊泡。

近年来的研究发现circRNAs可调节亲本基因的表达、选择性剪切或转录过程，其还具备海绵的特性：在特定调节下吸收或者释放miRNAs或RNAs。由于circRNAs的稳定性，其对miRNAs的吸附能力要优于mRNA与lncRNAs。circRNAs与miRNAs之间的密切联系使得其被认为对于肿瘤的发生和发展具有深远的影响。在Dou等[40]所测定的3种CRC细胞系中，肿瘤细胞以及肿瘤细胞所分泌的细胞外微囊泡中均包含circRNAs，外泌体circRNAs类型与肿瘤细胞有较高的重复，但外泌体中circRNAs的水平要明显高于肿瘤细胞。另外，其发现了KRAS突变的CRC细胞系中circRNAs的水平明显下调的现象。鉴于有相关研究发现相比于健康人组织中的circRNAs，无论是CRC细胞系还是患者的肿瘤组织circRNAs的水平均全面下调[41]，因此circRNAs可能与肿瘤的发生与发展相关。

4 结语

CRC对人类健康生活的威胁与日俱增，阐明其发生和发展的机制将有助于为早期诊断、治疗方式的选择和预后评估等提供极大帮助。外泌体属于肿瘤领域新兴的研究靶标，虽已有大量研究认可其在肿瘤微环境、启动肿瘤转移中的重要作用，但涉及具体机制的报道仍是少数，更多仅局限于体外实验所得到的表象结果。同时由于目前对于细胞外囊泡的分类方式仍旧不够明确，之前报道的部分文献结果并不能够完全明确研究对象，即究竟是仅包括外泌体，还是混杂有其他类型的细胞外囊泡。但从上文罗列的一些研究数据来看，血清中的外泌体已具备辅助临床诊断或预后判断的应用价值。后续如可有效筛选检测靶目标(蛋白质/miRNAs，单一或者多个组合)，规范化从抽提到检测的步骤，未来外泌体在临床检验中的应用前景可期。

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(本文编辑：许晓蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.03

上海市卫生计生系统重要薄弱学科建设项目(2015ZB0201)。

邬升超，1990年生，男，大学本科，研究方向为临床分子诊断。

潘柏申，研究员，E-mail:pan.baishen@zs-hospital.sh.cn。

R735.3

A

2017-05-18)