循环肿瘤细胞在临床应用中的挑战*

赵建华

(江苏省肿瘤医院/江苏省肿瘤防治研究所/南京医科大学附属肿瘤医院,江苏省临床检验中心，南京 210009)

·述评·

循环肿瘤细胞在临床应用中的挑战*

赵建华

(江苏省肿瘤医院/江苏省肿瘤防治研究所/南京医科大学附属肿瘤医院,江苏省临床检验中心，南京 210009)

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)的临床应用价值已经得到广泛认可，尤其作为“液体活检”的主要资源用于肿瘤精准医疗备受关注。然而，CTCs在患者血液中的含量极为稀少，灵敏度一直是CTCs检测及应用的主要瓶颈。目前，CTCs分离、富集、体外原代培养技术，获得细胞的生物学特性研究及其临床应用价值都还在不断探索和发展中，对它们的深层次和全方位的分析将有助于指导并推动CTCs的临床应用。

循环肿瘤细胞；精准医疗；生物学特征

肿瘤转移是癌症患者死亡的主要原因。由于大部分远端转移都是通过血液循环完成的，因此血液中存在的肿瘤细胞，即循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)，被认为是肿瘤复发转移的关键因素[1]。然而，CTCs在患者血液中的含量非常稀少，一般每106个白细胞中仅夹杂1个至几个CTCs，灵敏度一直是CTCs检测及其应用的主要障碍。迄今为止，尚未发现一项CTCs分离与检测技术能全面满足临床需求，CTCs分离、富集、体外原代培养、分子表观遗传特征的研究及其临床应用价值都还在不断探索和发展中，对它们的深层次和全方位的分析将有助于指导并推动CTCs的临床转化及应用。

1 CTCs分离技术仍在不断完善

目前临床上主要是通过CTCs的计数来预测肿瘤患者的复发、转移和生存。现阶段普遍使用的CTCs分离技术大致分为两类：基于细胞表面蛋白质表达的生物分离技术和基于肿瘤细胞物理学特点的物理分离技术。第一类技术中，以CellSearch平台为代表的阳性磁分离法使用最早且较广泛。其原理为上皮来源的肿瘤细胞表面广泛表达上皮细胞粘附因子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)，该类技术能基于EpCAM免疫磁性捕获上皮性CTCs；但CTCs中存在着发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)而丢失EpCAM的亚群，这类CTCs已被证明在乳腺癌发病过程中具有更高的转移效率和预后警示作用[2]。为了克服该缺陷，阴性磁分离法应运而生，它不依赖于CTCs的表型，可通过去除血液中白细胞而实现所有类型CTCs的检测。但该技术的CTCs回收纯度低且会出现假信号。第二类CTCs分离技术主要基于肿瘤细胞与血细胞在大小和/或形变能力上的差异，采用过滤或离心法富集CTCs。然而，尚无证据表明CTCs一定就是直径较大的或刚性强的细胞，磁性分离法获得的CTCs大小各异也证明了这一点，因此，该类方法虽简便易行但可信度和临床应用价值还有待验证。无论采用何种技术，CTCs的计数在判断各类癌症的复发转移和早期诊断上还需建立统一的标准，并且发展新的CTCs分离技术应同时进行系统的方法学比较，以提高其敏感性、特异性和有效性。

2 肿瘤精准治疗给CTCs的分离技术提出了更高的要求

精准治疗的焦点是根据肿瘤细胞所呈现的分子特点(如基因突变和特定基因或蛋白质表达等)选择相应的分子靶向治疗药物以获得最佳疗效。但肿瘤细胞具有高度异质性，治疗前需要对患者的肿瘤细胞进行异质性鉴定。然而，组织样本获取困难、瘤内癌细胞高度异质性及无法跟踪检测限制了其临床应用。“液体活检”成为理想的选择，且与其他液体活检材料(例如ctDNA和外泌体等)相比，CTCs具有更为突出的优势[3]。正如哈佛医学院Toner教授在《Science》杂志中指出：“完整的细胞具有巨大的价值；可以研究DNA、RNA、信号分子、磷酸化模式、表观遗传学，还可以通过培养这些细胞，测试药物敏感性，真正走向个性化医学”。目前主要有2个技术障碍使得CTCs的应用还难以真正在临床上展开：一是使用当前技术纯化CTCs后，样品中依然含有大量白细胞，CTCs的含量仅在0.1%～1%之间，难以通过测序技术(因基因测序要求样品中肿瘤细胞比例不低于10%～20%)准确鉴定其中的相关基因突变靶点；二是分离具有完整活性的CTCs还存在技术瓶颈。目前的CTCs分离技术包括多步的化学和物理操作过程，导致纯化后的CTCs无法继续培养而获得足够的数量用于高通量基因突变检测和药物筛查。尽管微流控芯片分离技术(CTC Chip)可获得CTCs的含量高达50%[4]，但其过程对CTCs的活性及生物学功能有影响；随后报道的CTC iChip技术尽管解决了CTCs活性不足的问题[5]，但CTCs纯化后的含量依然很低，难以直接用于靶基因突变检测。尽管如此，从CTCs的回收率和细胞活性上看，微流控芯片技术比其他分离技术具有突出的优势。有理由相信，基于微流控芯片的多技术组合将可能成为新一代高效能CTCs分离技术的发展方向；在此基础之上的大规模临床验证将全面推动CTCs在肿瘤精准治疗中的临床应用。

3 CTCs的临床应用离不开其本身的生物学功能与分子特性研究

目前主要集中在2个方向：一是发生EMT的CTCs；二是具有肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)特性的CTCs。在转移过程中，绝大部分CTCs会在机体免疫作用下发生凋亡,仅少数可存活下来形成转移灶。因而对CTCs进行简单计数而没有进一步的分子特性鉴定完全可能导致错误的临床判断和诊治[6]；同时由于目前CTCs分离技术在建立过程中都是通过不同病例组来进行临床应用验证，亦无标准化方案，导致CTCs的分选计数难以进行方法学比较，也无法在各种类别的肿瘤中形成统一的定量判定标准。近来的研究结果显示，基于分子特性鉴定以检测少数更具存活力和侵袭性的CTCs比单独CTCs计数更有价值[7-8]，这可能也为CTCs在临床应用中的标准化提供了一条可行之路。

4 与CTCs相关的一些基本临床应用问题

与CTCs相关的某些临床应用问题尚有待阐明，才能全面发挥CTCs的“液体活检”功能。目前的焦点主要包括以下4个方面：

4.1 CTCs检测是否能用于肿瘤的早期诊断？ 目前CTCs的存在与肿瘤发生与发展之间的关系还处于研究探索阶段。已有文献证实，肿瘤原发灶形成前CTCs就已经存在[9]，提示CTCs具有用于肿瘤早期诊断的潜力。但肿瘤早期阶段的CTCs检出率极低，这给临床常规应用带来了巨大挑战。综合文献，这一问题可能通过采取一些不同的策略逐步解决：首先，血液中的CTCs在时间和空间分布上是变化的，严格把控血液样品的采集部位及采样时间非常关键；其次，CTCs在血液中的数量极少，发展更敏感更特异的CTCs分离与检测技术也至关重要。

4.2 发生EMT的CTCs与临床的相关性如何？ EMT的发生与肿瘤细胞的CSCs特性有关[10]。由于CSCs被认为是肿瘤发生、转移和复发的根源，发生EMT的CTCs可能成为肿瘤远端转移的起源。然而，发生EMT的CTCs处于“冬眠”状态，无法增殖形成转移灶[10]。因此，这类CTCs与肿瘤转移及预后的相关性还需要进行大规模的临床验证，寻找新的特异性标志物以鉴别最终能形成转移灶的CTCs，已成为最迫切的需求。此外，CTCs的EMT特性鉴定目前还主要集中在晚期患者，如果能在早期患者中找到证据表明这类CTCs的存在且与患者后续出现转移密切相关，则能拓展CTCs的另一个重要功能，即在术前判断患者发生转移的可能性以优化手术方案。

4.3 CTCs的特性鉴定是否有助于预测肿瘤发生远端转移的部位？ 肿瘤细胞能从原发灶和转移灶组织的不同部位脱落入血形成CTCs，这些细胞具有高度异质性，向远端部位转移的潜能和组织/器官选择性也不相同[11]。因此，理论上来说，CTCs中存在具有组织特异性的CTCs亚群。目前这方面的研究尚未见报道。相信，随着CTCs分子特性研究的深入，这些具有选择转移性的CTCs亚群将可能为我们提供各种肿瘤的转移路线图谱。如果能够实现该目标，将进一步拓展CTCs的新功能，即有助于定位新的微小转移灶，提高临床监测患者复发的效率。

4.4 CTCs的基因分型与表型鉴定能否用于指导肿瘤的精准治疗？ 液态活检由于具备无创检测肿瘤状况的独特优势，正逐渐成为“精准医疗”代表性检测手段，同时也极大推动了产业化开发的进程。其中，通过CTCs检测非小细胞肺癌EGFR基因突变和乳腺癌表皮生长因子-2(HER2)表达已成功用于相应的靶向治疗[12-13]。因此，CTCs的基因分型与表型鉴定用于指导肿瘤精准治疗是发展趋势。然而，与化疗药物一样，患者对靶向药物的响应也并非是持久性的；随着治疗的进行，肿瘤驱动基因突变谱将会发生变化，耐药的实时监测及其治疗方案的持续调整优化对患者的疗效及预后至关重要，但组织活检无法承担这一责任。CTCs检测优点在于不仅能通过总体和分类计数对肿瘤进展进行实时监测；而且还能对完整肿瘤细胞进行实时鉴定并展开细胞功能研究，在单细胞水平研究分析肿瘤细胞群体异质性及其与治疗进展的相关性。当然这些都需要高灵敏度的CTCs分离、富集与检测技术、体外原代培养技术、以及单细胞研究技术的发展和支撑。

5 小结及展望

CTCs的临床应用不仅面临技术上的问题，还存在大量的实际应用问题有待解决。一个好的CTCs分离技术应当同时具有以下4个方面的优势：其一，能够获得足量的CTCs，这是其临床应用可靠性的重要前提；其二，分离出的CTCs具有足够的纯度，这是准确鉴定其基因型和表型用于肿瘤精准治疗的技术前提；其三，获得的CTCs具有完整的活性，能够继续培养获得足够的数量，以用于大规模的药物筛查和基因鉴定；其四，能够分离出全部类型的CTCs，这为其临床应用的有效性提供保障。为此，需要通过大规模的临床试验解决CTCs在应用过程中存在的问题，并对其定量和鉴定依据进行标准化，才能为临床诊疗提供全面而有价值的指导。

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(本文编辑：许晓蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.01

江苏省重点研发(社会发展)计划基金(BE2015078)。

赵建华，1964年生，女，研究员，硕士，E-mail:Jhzhao2838@sina.com。

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2017-06-28)