抗体介导的假性血小板减少及其解决方法*

朱建锋，郭玮，潘柏申

(复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032)

·专题笔谈·

抗体介导的假性血小板减少及其解决方法*

朱建锋，郭玮，潘柏申

(复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032)

假性血小板减少(PTCP)是指血液分析仪计数得到的血小板结果明显低于血小板真实值。尽管存在多种原因可导致PTCP，但临床上主要用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，故PTCP以乙二胺四乙酸(EDTA)引起的血小板假性减少(EDTA-PTCP)为主。鉴别EDTA-PTCP快速、直观的方法是制作血涂片并通过显微镜观察血小板，一旦发现血小板聚集现象，则用其他方法计数血小板以避免误诊和其他不必要的检查、治疗及相关费用。

假性血小板减少；抗凝剂；解决方法

假性血小板减少(pseudothrombocytopenia，PTCP)是指抗凝血液中血小板聚集，导致血液分析仪无法识别血小板，引起血小板计数结果明显低于血小板真实值。这种情况在临床易被误诊为免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia，ITP)，进而引起不必要的检查、治疗及相关费用。

引起PTCP的原因主要有以下3种：(1)抗体介导的血小板聚集，最常见原因是抗凝剂乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)引起的假性血小板减少(EDTA-dependent pseudothrombocytopenia，EDTA-PTCP)和血小板卫星现象；(2)未正确采集血标本或抗凝剂未充分混匀而致血小板活化引起血小板聚集；(3)其他一些巨大血小板引起血小板计数假性减低。本文主要讨论抗体介导的PTCP。

1 抗体介导的PTCP的主要类型

1.1EDTA-PTCP 1951年，Proesche记载了EDTA作为一种抗凝剂可用于血液检测，但直到1969年Gowland等[1]报道了2例EDTA-PTCP。EDTA-PTCP机制较复杂、尚不完全明确，主要是在体外受到免疫(血小板抗体)、化学(抗凝剂)和物理(温度)等因素共同作用引起血小板假性减少现象。门诊EDTA-PTCP发生率约0.09%～0.11%[2]，住院患者约1.9%[3]。抗凝剂EDTA螯合钙离子引起血小板膜蛋白构象改变，暴露抗原决定簇，与体内一些自身抗体结合。这些抗体多数是4～20 ℃时反应活性最强的冷抗体，IgM出现频率较IgG高，而IgA极少；而约20%在22 ℃与37 ℃时反应也较活跃，几乎均为IgM型抗体。将患者血浆或血清与健康人EDTA抗凝血混合后能重现血小板聚集现象，提示抗体直接作用的抗原广泛存在[4]。

1.2枸橼酸盐引起PTCP 发生EDTA-PTCP时，枸橼酸盐常作为替代抗凝剂用于纠正EDTA引起的血小板聚集。但有10%～20%标本改用枸橼酸盐抗凝检测后仍然存在血小板聚集，不能纠正EDTA-PTCP。因为枸橼酸盐螯合钙离子，与体内的一些自身抗体结合，发生血小板聚集现象。这些抗体多为IgM型，可能与37 ℃时EDTA抗凝剂诱导的PTCP为同一种抗体类型[2]。

1.3其他抗凝剂引起PTCP 文献报道有许多替代的螯合或非螯合作用的抗凝剂[5-12]，如肝素钠、草酸铵、氟化钠、β-羟乙基茶碱、枸橼酸钠-5-磷酸吡哆醛-Tris缓冲液(citrate-pyridoxalphosphate-Tris，CPT)、枸橼酸-枸橼酸钠-葡萄糖(acid-citrate-dextrose,ACD)、枸橼酸钠-茶碱-腺苷-潘生丁(citrate-theophylline-adenosine-dipyridamole,CTAD)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA)、叠氮化钾、氯化钙/肝素钙等。尽管这些抗凝剂常作为一种替代抗凝剂，但实际上很多抗凝剂会引起PTCP，故不能完全适用于常规血液检查。CPT被证实能有效防止血小板聚集，同时能获得准确的血细胞计数结果，有望取代EDTA，但需要校正红细胞压积与体积，且检测成本较EDTA高，尚未推广使用[13]。德国的一项研究显示，以硫酸镁为抗凝剂的商品化采血管可用于纠正PTCP，同时不影响红细胞、白细胞及白细胞分类等结果[14]。

1.4血小板卫星现象导致PTCP 1963年，Field和MacLeod最早记载了一位14岁少年的抗凝外周血涂片中发现5～10个血小板围绕于中性分叶核粒细胞外围，偶见20个以上血小板；而单核、淋巴细胞未发现该现象[15]。随后陆续有少量报道[16-17]，主要见于体外EDTA抗凝标本中，以血小板聚集在多形核细胞(polymorphonuclear，PMN)周围的形态特征而得名[18]。也有单核与淋巴细胞卫星现象报道[19-20]。它是一种自身抗体引起的免疫反应现象，只是不同于血小板聚集抗体类型，为37 ℃无活性的IgG。抗体作为连接血小板和PMN之间的桥梁，将靶抗原血小板GPⅡb/GPⅢa和中性粒细胞FcγRⅢ受体连接起来，形成血小板围绕在分叶核细胞表面的现象。血小板卫星现象导致的血小板假性减低程度没有EDTA-PTCP严重，对仪器血小板计数结果的影响相对较小。也正因为如此，某种程度上可能低估了血小板卫星现象的发生率。

1.5药物治疗引起PTCP 一些单抗药物治疗后可发生PTCP，经皮冠脉造影患者为预防血栓形成，服用阿昔单抗时会出现PTCP，发生率为2.1%。对于此类患者必须明确真性或假性血小板减少，若为真性血小板减少，则必须停药，同时需输注单采血小板；而PTCP则可继续抗凝治疗。文献报道1例ITP患者接受TPO(thrombopoietin，TPO)受体激动剂药物罗米司亭治疗后，出现血小板聚集现象，导致血小板假性减低发生[21]；此时需明确是否为EDTA-PTCP，避免错误评估药物疗效。

2 抗体介导的PTCP的发生机制

EDTA-PTCP产生的确切机制尚不完全清楚，但通常认为是一种免疫机制介导的现象，发生在体外血液中，EDTA依赖性血小板自身抗体诱导血小板聚集。Pegels等[22]发现一种血小板无力症，即Glanzmann病(Glycoprotein GPⅡb/GPⅢa缺失，血小板膜糖蛋白GPⅡb/GPⅢa缺失)，无此现象发生，从而推测抗体作用位点是GPⅡb/GPⅢa。研究发现EDTA-PTCP的自身抗体主要作用于血小板GPⅡb[23]。GPⅡb是一种Ca2+依赖蛋白质，Ca2+存在时其与GPⅢa组成异源二聚体。当Ca2+浓度降低时，GPⅡb/GPⅢa二聚体解离，显露出GPⅡb上的隐性表位，而一些自身抗体正是作用于这一隐性表位，从而引起血小板聚集。因此，该现象是EDTA抗凝剂对钙离子的螯合效应所致，并非EDTA本身引起，所以具有螯合作用的枸橼酸钠等抗凝剂一定程度上均会引起血小板假性降低。

血小板卫星现象导致PTCP发生的机制可能为体内一些自身抗体可作为桥梁连接血小板和PMN，由于PMN细胞表面的是FcγRⅢb结构，而自然杀伤细胞和单核细胞表面的是FcγRⅢa结构。PMN以Fab端连接血小板出现血小板围绕的特征，而NK细胞和单核细胞以Fc端链接血小板，从而引发Fc端介导的吞噬作用，周围血涂片可见血小板被吞噬现象[24]。至于何时发生血小板聚集现象或血小板卫星现象，原因仍不清楚，可能是存在两种针对不同血小板GPⅡb/GPⅢa的自身抗体。而药物引起PTCP的产生机制与EDTA-PTCP相似，是人鼠嵌合Fab片段单抗能结合血小板GPⅡb/GPⅢa复合物的β3亚基，引起血小板膜构象改变，进而发生EDTA-PTCP[25]。

3 检测PTCP的重要性

PTCP可发生于自身免疫病、炎症、病毒或细菌感染、代谢综合征、肿瘤、干细胞移植患者及妊娠者中。健康人群中也可发生PTCP，且维持长久，提示这类自身抗体与人群未来患病之间并无关联。PTCP患者无出血或血栓形成的风险，不必进行其他实验室检查或治疗。但有报道患者因PTCP而被收治入院进行不必要的治疗[26-27]，如单采血小板输注，骨髓穿刺与活检术，长期皮质醇激素治疗，脾切除手术，也有误诊为血小板减少症，给患者带来不必要的身心压力。报道对低温心脏手术的PTCP患者，即使体温降到28～30 ℃仍可行冠状动脉旁路移植术或瓣膜置换手术[28]。Sweeney等[29]报道输注PTCP供体血液后未见输血不良反应及PTCP，提示PTCP健康人群血液制品可用于输血治疗。另有报道，急性冠脉综合征患者中，因PTCP而未能及时进行肝素、溶栓治疗导致不良后果发生[30]。所以PTCP的重要性在于准确判断、及时纠正血小板结果，从而避免不合理的检查、输血及疾病误诊、误治。

4 实验室解决方法

血小板聚集成团后体积大小等同或大于白细胞，根据血细胞分析仪的电阻抗原理，仪器将聚集成团的血小板误认为白细胞进行计数，导致白细胞计数假性升高和PTCP。因此，检验人员必须重视EDTA-PTCP，确定EDTA-PTCP快速、直观的方法是血涂片人工显微镜检查，一旦发现血小板聚集现象，标本需采用其他方法检测。而在添加上述抗凝剂的采血管尚未商品化之前，更换枸橼酸钠抗凝剂或末梢血采血检查具有一定可操作性。然而仍需警惕无法纠正的少数案例，即更换枸橼酸钠抗凝管也不能纠正血小板结果的情况。而末梢血显微镜计数血小板尽管存在重复性与精密度等问题，目前而言仍不失为一种血小板计数的“金标准”方法。文献报道外周血涂片显微镜检查发现血小板聚集后的解决方法[4]：首先排除静脉穿刺不顺、抗凝剂比例不当或标本未及时混匀等不恰当的标本采集方式；然后使用37 ℃预热管采集，并置于37 ℃恒温箱中直至检测，采用急诊或优先模式上机检测，确保标本未冷却，不推荐对冷却标本反复温浴、检测；按上述操作检测后，仍有10%～20%病例存在EDTA-PTCP，则提示存在IgM抗体。此类标本使用枸橼酸钠管也不能纠正血小板结果，建议采集末梢血进行改良牛鲍氏手工计数血小板；最后登记患者信息，告知患者下次血常规检查时需37 ℃恒温采血，或末梢采血计数血小板。

总之，PTCP发生与血液分析仪自动化程度或真空采集管使用有密切关系，国外自动化程度起步较早，相应报道比较多且全面。随着我国检验科自动化仪器及真空采集管的普遍运用，这种EDTA-PTCP也渐渐为检验工作者熟悉。尽管仪器能快速地提供血常规结果，局限在于不能很好地提示EDTA-PTCP，对于患者无瘀点、瘀斑等血小板减少症相关表现的血小板严重减少标本必须进行显微镜人工镜检复核，可避免误诊以及所带来的不必要后果。

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R446

A

2017-03-03)

(本文编辑王海燕)

国家自然科学基金面上项目(81572064)；上海市卫生计生系统重要薄弱学科建设项目(2015ZB0201)。

朱建锋，1977年生，男，主管技师，大学本科，主要从事外周血与骨髓细胞形态学检查工作。

潘柏申，研究员，E-mail：pan.baishen@zs-hospitial.sh.cn。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.09.12