青蒿素纳米脂质体的制备及其药效学研究

陆慧(燕山大学环境与化学工程学院生物系，河北 秦皇岛 066004)

张海朝 栗坤(燕山大学，河北 秦皇岛 066004)

青蒿素纳米脂质体的制备及其药效学研究

陆慧(燕山大学环境与化学工程学院生物系，河北 秦皇岛 066004)

张海朝 栗坤(燕山大学，河北 秦皇岛 066004)

目的：通过对青蒿素纳米脂质体的处方和制备工艺的研究，研制高包封率和高稳定性的脂质体。方法:采用薄膜水化法制备脂质体，以正交实验优化处方，测定脂质体中药物的包封率，并初步考察脂质体的稳定性。结果:优化处方与工艺所得脂质体形态均匀，包封率大于43%，粒径为194 nm，Zeta电位为-32.8 mV；在-4℃条件下，观察这些药品贮存2周和4周后，无显著变化，具有良好的稳定性。采用U14宫颈癌荷瘤小鼠模型研究青蒿素纳米脂质体的抗肿瘤效果，其抑制率为71.86%，与青蒿素水溶液比较有较好的抗肿瘤效果（P＜0.01）。结论:薄膜水化法制备脂质体工艺简便，制备出的脂质体包封率高，稳定好，抑瘤率高。

青蒿素；脂质体；薄膜水化法；包封率；抑瘤率

青蒿素（Artemisinin）是从青蒿、黄花蒿等植物中分离提取出来的具有过氧化基团的倍半萜内脂类化合物，青蒿琥珀（Artesunate）和双氢青蒿素（Dihydroartemisinin）等均为青蒿素的衍生物[1]。青蒿素类药物不仅是目前抗疟特效药，还可以选择性抑制和杀灭多种肿瘤细胞，具有良好的耐受性，毒副作用较小，具有显著的抗肿瘤作用[2]。1992年邓安定首次报道了青蒿素衍生物对小鼠白血病P388细胞具有一定的杀伤活性[3]。Efferth等人在研究青蒿琥酯对55种癌细胞株的抗癌活性时发现，青蒿琥酯对白血病细胞和结肠癌细胞的抗癌活性最强，对黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、中枢神经系统肿瘤及肾癌细胞等有中度活性，对非小细胞性肺癌细胞的活性最弱[4]。目前该类药物上市的剂型主要是普通的片剂、栓剂、注射剂，这类药物在体内代谢迅速、消除半衰期短、生物利用度低、疟原虫复燃率高等缺点[5]。因此，研发青蒿素类药物新剂型以降低复燃率、增加溶解度、提高生物利用度、增强靶向和缓释作用已成为当前的研究热点之一。本研究利用大豆卵磷脂、胆固醇等来制备青蒿素纳米脂质体，以提高药物的稳定性、缓释效果和药物的治疗指数。

1 材料与仪器

青蒿素（Artemisinin）、大豆磷脂酰胆碱（SPC，AR）、胆固醇（CHOL，AR）、甲醇（CH2OH，AR）、二氯甲烷（CH2Cl2，AR）、U14宫颈癌细胞株。

JY-2002型电子天平（上海精密仪器有限公司）；R系列旋转蒸发器 （上海申生科技有限公司）；超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Allegra 64R台式高速冷冻离心机（Beck⁃ man Coulter）；722s型紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）；Zetasizer Nano-90激光粒度测定仪（Malvren公司）。

2 方法与结果

2.1 工艺设计与优化

2.1.1 工艺设计

通过有关文献[6]及单因素考察实验，分析确定了影响青蒿素纳米脂质体包封率的4个主要因素，即脂质体与药物的质量比（A）、大豆卵磷脂与胆固醇的质量比（B）、甲醇与二氯甲烷的体积比（C）、成膜的温度（D）。采用正交试验来筛选处方，各因素取3水平，以包封率和载药量为指标，选用L9(34)正交表安排实验，制备1～9号脂质体。以包封率为衡量标准指标进行直观分析。由方差分析可知：包封率的影响因素大小为A＞D＞B＞C，A对包封率有显著影响，C无显著影响，其中最优工艺条件为：A（10:1）、B（2:1）、C（2:4）、D（40）。即大豆卵磷脂80mg，胆固醇20mg，甲醇2ml，二氯甲烷4ml，青蒿素10mg，成膜温度40℃。

2.1.2 验证实验

按优选工艺制备3批青蒿素纳米脂质体，平均包封率为43%。表明优选处方和工艺得到的青蒿素纳米脂质体稳定可行。电子显微镜下观察，所得3批青蒿素纳米脂质体形态圆整，粒径小而均匀。

2.2 青蒿素纳米脂质体的制备工艺

采用薄膜水化法制备脂质体，按正交试验得到的最佳处方组成，固定其余各原料用量。称取适量大豆卵磷脂、胆固醇、青蒿素加入到25ml茄型瓶中，再向瓶中加入二氯甲烷和甲醇，放入超声仪中超声2min使其充分溶解。然后再将此混合溶液利用旋转蒸发仪在40℃水浴下进行梯度抽真空使其均匀成膜。加入一定量的超纯水充分水和，在60℃水浴下震荡水化30min使膜脱落，在60℃水浴中超声20min至形成脂质体水性悬浊液，经过0.45um和0.22um滤膜过滤2次，即得青蒿素纳米脂质体。置于-4℃冰箱中保存备用。同法制得空白纳米脂质体。

2.3 脂质体的表征

2.3.1 物理和化学性质

在制备脂质体时有许多因素需要考虑，包括技术和处方的因素。经过多次处方优化实验，获得了最佳制备工艺。空白纳米脂质体是泛蓝光的乳悬液，青蒿素纳米脂质体是淡黄色的混悬液。

2.3.2 脂质体电镜观察

取少量青蒿素纳米脂质体蒸馏水稀释，滴至载玻片上，用磷钨酸负染，再滴至专用铜网上，自然挥干，使粒子在铜网上沉积，电镜下观察，脂质体为粒径较均匀的球状或近球状小囊泡，彼此分离，粒径约为200 nm，空白纳米脂质体和青蒿素纳米脂质体的形状是球形，表面光滑，多为单室脂质体。

2.3.3 Zeta电位及粒径与粒度测定

青蒿素纳米脂质体用Zetasizer Nano-90激光粒度测定仪进行粒径分布测定，可见青蒿素纳米脂质体粒径集中分布在150～220nm范围内；Zeta电位平均值为-32.8mV。

2.3.4 包封率的测定

青蒿素溶解在超纯水和甲醇混合溶剂（V/V 1：2）中，得到浓度为100μg/ml的溶液，然后将混合物稀释为50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml，3.125μg/ml。然后使用紫外可见分光光度计在λmax=275nm的波长下进行检测青蒿素含量。以质量浓度为横坐标x，吸光度为纵坐标y绘制标准曲线，得吸光度y与青蒿素浓度x线性范围为3.125～50μg/ml的标准曲线方程：Y= 69.4069X+0.5699（R2=0.9827）。青蒿素溶液的紫外可见吸收光谱。用超速离心法分离未包封的药物，取适量的青蒿素纳米脂质体在50000r/min下离心40min。然后，将未包封的青蒿素溶解在超纯水和甲醇混合溶剂（V/V 1：2）中，按上述方法检测青蒿素含量。其浓度根据线性回归方程计算出。药物包封率（EE%）用下面的公式（1）来计算。

公式（1）：EE%={W(total)-W(free)}/W(total)×100%

2.4 青蒿素纳米脂质体在小鼠体内的药效学研究

2.4.1 小鼠肿瘤模型的建立

在三只小鼠腹腔内注射0.3 ml浓度为1×107个/ml的U14宫颈癌细胞。当小鼠腹部明显变大时，抽出腹水生理盐水稀释为1×106个/ml，取0.3 ml宫颈癌细胞小鼠前肢腋下，接种后第三天，肿瘤在小鼠腋下生长良好，表明接种成功，成功率为100%。成功接种的小鼠分成4组，每组8只，命名如下：

阴性对照组：生理盐水静脉注射（0.4 ml/只）；

阳性对照组：青蒿素（80 mg/kg），灌胃0.2 ml/只，根据课题组前期研究表明，这种剂量青蒿素对肿瘤生长有明显的抑制作用；

青蒿素组：青蒿素静脉给药，0.4 ml/只；

青蒿素纳米脂质体组：青蒿素纳米脂质体静脉给药，0.4 ml/只。

所述小鼠施用上述制剂15天。在16日当天，处死小鼠，然后从小鼠体内取出肿瘤组织并称重，以检测抑瘤率。

抑瘤率分别根据公式2计算：

（公式2）：抑瘤率=（阴性对照组肿块-实验组瘤质量）/阴性组肿瘤质量×100%

2.4.2 青蒿素纳米脂质体对肿瘤的抑制作用

青蒿素纳米脂质体组与阳性对照组对肿瘤生长的抑制作用无差异；青蒿素纳米脂质体抑瘤作用明显（P＜0.01）。与阳性对照组相比较，★P＜0.05；与青蒿素组相比较，◆P＜0.01。

3 讨论

本试验所用的成膜材料为大豆卵磷脂和胆固醇，其中胆固醇可以调节膜的流动性，一定比例的胆固醇可减少膜的稳定性，增加脂质体的稳定性，从而提高包封率。通过本实验可以看出大豆卵磷脂与胆固醇质量比为4:1时包封率最高。在本实验中，影响脂质体包封率的一个重要因素是药物与脂质的质量比。在多次的处方优化过程中发现，药物浓度过高或过低都会影响脂质体的包封率，随着药物浓度的增大，包封率先增大后减小，说明青蒿素纳米脂质体的包封率可能具有饱和性[6]。一般情况下，包封率会随着药脂比的增高而提高。本实验在制备青蒿素纳米脂质体混悬液过程中，对梯度抽真空和吹氮气的方法进行了考察。结果表明，梯度抽真空法更适合青蒿素纳米脂质体的制备。所得脂质体形态圆整，包封率高，且处方稳定性好，方法操作简单，而吹氮气法资金花费更大。Zeta电位的测量结果可以用于预测脂质体分散体系的物理稳定性。一般情况下，Zeta电位绝对值越大，说明脂质体之间的经典排斥力越大，体系越不容易发生聚集，稳定性越高。本实验制得的青蒿素纳米脂质体平均电位为-32.8mV，说明体系较稳定。在本实验中，通过对小鼠的抑瘤率的检测，最终结果说明青蒿素纳米脂质体明显改善了青蒿素的生物利用度，达到了改善青蒿素生物利用度的目的。

因此，研究表明，青蒿素纳米脂质体将成为未来癌症治疗的一个有效的运载工具。

[1]樊嵘,谢红,杨磊等.青蒿素及其衍生物抑制K562细胞生长作用比较[J].武警医学院学报,2006,15(3):199-201.

[2]温悦,孟德胜.青蒿素类药物药理作用研究进展[J].医药导报，2007,10(4)：1193-1195.

[3]邓定安.有抗肿瘤活性的青蒿B衍生物[J].药学学报, 1992,27(4):317-320.

[4]EFFERTHT,DUNSTANH,SAUERBREYA,et al.Theantimalarial artesunateisal so active against cancer[J].Int J Oncol, 2001,18(4):767-773.

[5]张东,王满元,杨岚.青蒿素类药物新制剂研究进展[J].中国药学杂志,2015,03.001.

[6]瞿建江,冯淑华.青蒿素纳米脂质体的制备及性能研究[J].中国现代应用药学2010,09:14-22.

[7]SHEN X K,YAN K D,LUO Z Y,et al.Determination of ar⁃teannuin element content by the ultraviolet spectrophotometric[J]. J Pharm Anal,1983(3):24-26.