超高压处理对蓝靛果抗氧化物提取量及活性的影响

李新原，颜廷才，李 斌，刘素稳，孙希云，汪艳群，张 琦，霍俊伟，孟宪军,*

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866；2.河北科技师范学院食品科技学院，河北 秦皇岛 066600；3.东北农业大学园艺学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

超高压处理对蓝靛果抗氧化物提取量及活性的影响

李新原1，颜廷才1，李 斌1，刘素稳2，孙希云1，汪艳群1，张 琦1，霍俊伟3，孟宪军1,*

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866；2.河北科技师范学院食品科技学院，河北 秦皇岛 066600；3.东北农业大学园艺学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

研究超高压处理对蓝靛果中总抗氧化物、花色苷、多酚、VC提取量及总抗氧化活性的影响，探索细胞微观结构与总抗氧化物提取量的关系。结果表明：提取压力为300 MPa时总抗氧化物提取量最高，为85.20 mg/g（以鲜果计）；总抗氧化物冻干粉中总酚、花色苷、VC含量分别在300、400 MPa和对照组中最高，分别为136.48、4.12 μg/mg和27.14 μg/mg。提取压力为400 MPa时，总抗氧化物对2,2’-联氨-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐自由基清除能力（0.37 mmol/L）、Fe3＋还原能力（0.84 mmol/L）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力（91.5%）最大，表明400 MPa压力条件下提取的抗氧化物活性最高。观察电子显微镜图片发现400 MPa处理对蓝靛果细胞破坏巨大，有利于抗氧化物的提取，从细胞微观结构角度证明超高压处理可以提高蓝靛果抗氧化物提取量；差异显著性分析表明VC、花色苷含量部分组之间不显著，其他组之间差异显著。通过本实验证实：超高压处理可以促进蓝靛果细胞破碎，有利于溶剂与抗氧化物接触，提高抗氧化物的提取量及抗氧化活性。

蓝靛果；超高压；抗氧化；细胞结构

蓝靛果忍冬（Lonicera enulis Turcz）简称蓝靛果，属被子植物门忍冬科忍冬属。在中国东北、华北、西北、四川等地山区和俄罗斯远东地区、日本及朝鲜北部等地都有分布。果实中含VB1、VB2、Vpp等多种维生素，还含有丰富的黄酮类多酚、花青素、VC、芸香苷等抗氧化成分[1-4]。据Pertuzatti[5]、Yuan Yuan[6]、李斌[7]等研究报道，花青素、多酚具有清除体内自由基、保护肝脏、预防糖尿病等作用[8-10]。目前抗氧化成分较常用的提取方法是溶剂浸取法，通常采用酸性溶液进行提取，此外还有微生物破壁法、CO2超临界萃取、酶解提取法、超声波提取法、微波提取法等[11-14]。但由于花色苷稳定性较差，易受pH值、温度、金属离子、光照、辅色素等因素的影响，提取的抗氧化成分活性不高，这很大程度上限制了其保健功能的发挥与产品应用。

超高压（ultrahigh pressure，UHP）技术是将液体或气体加压到100 MPa以上的技术。具有冷杀菌与增加有效成分提取量的作用，目前超高压技术在食品、制药、地质研究等很多领域都有应用。在食品领域主要作为一种冷杀菌方法，尤其对新鲜果汁杀菌具有很大的优势，在保存原有口感不变的情况下，能保证营养物质得到最大保留。在制药领域主要将超高压处理作为一种辅助提取方法，利用超高压将中草药细胞破坏，使细胞内容物外流，有利于溶剂与提取物接触，从而提高提取量。另外，与传统方法相比超高压处理具有提取时间短、效率高、成本低、可减少高温对提取物质的影响、提高产品的质量和产量等优点[15-19]。李斌[7]、岳晓霞[18]等对蓝靛果色素和多酚的提取和抗氧化作用已做了相关研究，但关于超高压处理对蓝靛果总抗氧化物影响的研究鲜见报道。本实验利用UHP技术研究了超高压处理对蓝靛果总抗氧化物的提取量和抗氧化活性的影响，实验压力范围为100～600 MPa，并通过电子显微镜观察到超高压处理对蓝靛果细胞具有破坏作用，从微观角度解释了超高压处理可以提高抗氧化物提取量的原因，为蓝靛果抗氧化物的开发和深加工提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜野生蓝靛果采自吉林省白山市，由沈阳农业大学食品学院小浆果加工实验室提供。

2,4-二硝基苯肼、福林-酚试剂、没食子酸标准品、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美国Sigma公司；2,2’-联氨-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐自由基（2,2’-azino-bis(3-ehtylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt radical，ABTS＋•）试剂盒、Fe3＋还原能力（ferric reducing ability of plasma，FRAP）试剂盒碧云天生物技术有限公司；丙酮、盐酸、氢氧化钠、无水碳酸钠 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

JYL-C012九阳榨汁机、电子分析天平、PHS-3C型pH计 北京赛多利斯科学仪器有限公司；真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；UV-1600型紫外-可见分光光度仪 北京瑞利分析仪器公司；BCD-186KB型冰箱 青岛海尔电器有限公司；全制动超高压杀菌机 温州滨一机械科技有限公司；HT7700透射电子显微镜、离心机 日本日立公司；酶标仪 美国博腾仪器有限公司；LG0.2真空冷冻干燥机 沈阳新阳速冻设备制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超高压提取抗氧化物

将新鲜蓝靛果果实打浆后每30 g为一个样品，以液料比10∶1加入酸化丙酮（0.1% HCl、60%丙酮溶液）于聚对苯二甲酸乙二醇酯瓶中，将样品分别置于0（对照）、100、200、300、400、500、600 MPa条件下处理15 min后，在离心机中4 000 r/min离心15 min，取上清液旋转蒸发浓缩后，真空冷冻干燥收集粉末作为样品备用。并按公式（1）计算抗氧化物提取量，结果以鲜果计。

式中：m为抗氧化物冻干粉/mg；M为蓝靛果样品质量/g。

1.3.2 多酚含量测定

采用福林-酚法[19]进行测定，将上1.3.1节中的粉末配制成1 mg/mL 水溶液，取样品1 mL，加入福林-酚试剂2 mL，混匀，在0.5～8.0 min内加入3 mL质量分数7.5%的Na2CO3溶液，充分混合，30 ℃避光放置2 h后，测定波长765 nm处的吸光度。以没食子酸为标样，绘制标准曲线，所得标准曲线方程为：y=0.081 01＋5.011 39x（R2=0.999 8）。没食子酸在0.005～0.050 mg/mL质量浓度范围内具有良好的线性关系，根据标准曲线方程求出提取液中多酚质量浓度/（mg/mL）。多酚含量按式（2）计算，结果以没食子酸计。

式中：X为冻干粉样品中多酚含量/（μg/mg）；ρ为根据标准曲线方程计算出待测液中多酚的质量浓度/（mg/mL）；V为待测液体积/mL；N为稀释倍数；m为冻干粉样品质量/mg；1 000为mg转化为μg的因子。

1.3.3 花色苷含量测定

本实验采用pH示差法[20]测定花色苷含量。将1.3.1节中的粉末配制成1 mg/mL水溶液，取同一样品各1 mL，分别加入pH值为1.0、4.5的缓冲溶液9 mL，室温条件下平衡20 min后，以蒸馏水为空白，于510 nm 和700 nm波长处测定其吸光度（A510nm、A700nm），计算花色苷含量。稀释后样品的吸光度（ΔA）按式（3）计算，冻干粉中花色苷含量按式（4）计算。

式中：Mw为矢车菊3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2；DF为样品的稀释倍数（初始稀释倍数×缓冲液的稀释倍数）；V为加入样品体积/mL；m为加入冻干粉的质量/mg；1 000 为单位转化数值；L为比色皿光程（一般为1 cm）；26 900为矢车菊3-葡萄糖苷摩尔吸光系数/（L/mol）。

1.3.4 VC含量测定

采用2,4-二硝基苯肼法[21]，原理为样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2,4-二硝基苯肼作用生成红色脎，脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，可利用比色法测定，根据标准曲线计算出待测样品的VC含量。

1.3.5 抗氧化能力测定

1.3.5.1 ABTS＋•清除能力测定

总抗氧化能力检测方法参考文献[22]，取1.3.1节待测样品粉末配制成质量浓度为1 mg/mL的磷酸盐溶液。取96 孔板，在每个检测孔中加入200 μL ABTS工作液后将10 μL待测液放入检测孔中，轻轻混匀。室温孵育2～6 min后测定其在734 nm波长处吸光度，根据标准曲线计算出待测样品的ABTS＋•清除能力。

1.3.5.2 FRAP值测定

[23]，取1.3.1节待测样品粉末配制成质量浓度为1 mg/mL的磷酸盐溶液。取96 孔板，在每个检测孔中加入180 μL FRAP工作液。后将5 μL待测液放入检测孔中，轻轻混匀。37 ℃孵育2～6 min后测定其在593 nm波长处吸光度，根据标准曲线计算出待测样品的FRAP值。1.3.5.3 DPPH自由基清除能力测定

将1.3.1节的粉末配制成1 mg/mL溶液作为待测液，参照吕春茂等[24]的方法略作改动，配制0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，放在避光低温条件下保存，在试管中加入2 mL DPPH-乙醇溶液及2 mL样品溶液，在室温避光放置30 min，于517 nm波长处用无水乙醇调零，并测定吸光度（A1）；将DPPH-乙醇溶液用等体积的无水乙醇代替，其他操作相同，测定吸光度（A2）；将样品溶液用等体积无水乙醇溶液代替，其他操作相同，测定吸光度（A0），DPPH自由基清除率按公式（5）计算。

1.3.6 细胞微观结构的观察

本实验制片方法采用超薄切片技术，将未处理和在超高压400 MPa处理后的蓝靛果用刀片切成1 mm3组织小块，经过固定、脱水、包埋、固化、超薄切片、染色制成透射电子显微镜切片备用。将切片放在透射电子显微镜下观察，首先在放大1 000 倍下观察各组处理后蓝靛果细胞的整体形态评估其受超高压处理之后的破坏程度，其次在放大3 000 倍下观察蓝靛果组织细胞细胞壁在超高压处理后的松散程度以及细胞内容物存在状态。

1.4 数据处理与统计分析

所有实验重复3 次，采用Excel 2007软件对实验数据进行整理绘图，用SPSS 18.0软件对数据进行方差分析，并进行Duncan’s差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 超高压处理对提取量的影响

表1 提取压力对抗氧化物提取量的影响Table1 Effect of extraction pressure on the extraction ef fi ciency of antioxidants

表1为不同压力下蓝靛果总抗氧化物的提取量。由表1得出，经过100～600 MPa超高压处理样品中抗氧化成分的提取量，极显著高于对照组（P＜0.01），且提取量随着压力升高呈现先升高后下降的趋势，在提取压力为300 MPa时提取量最大达到85.2 mg/g，而对照仅为78.4 mg/g。说明超高压处理具有提高蓝靛果总抗氧化物提取量的作用。

2.2 超高压提取对蓝靛果冻干粉中总酚含量的影响

图1 提取压力对总酚含量的影响Fig.1 Effect of extraction pressure on the yield of total phenols

据Xi Jun等[26]研究报道，超高压提取可以提高茶总酚的提取量及其抗氧化活性。图1为不同压力下冻干粉样品中总酚含量，可以看出样品中总酚的含量随着压力的升高先增大后减小，当压力为300 MPa时提取量最大为136.48 μg/mg，且各组总酚含量差异显著（P＜0.05）。100 MPa与对照组相比总酚含量较低，说明在100 MPa环境下蓝靛果总酚不稳定。一般来说压力越大植物细胞受到压力的破坏作用越大，越有利于植物总酚物质的提取[19]，但实验中提取压力高于300 MPa时总酚含量下降，造成这种现象的原因可能为，压力过高使蓝靛果中蛋白质分子结构改变，位于分子折叠结构中易于接近的反应位点得到充分暴露，并与小分子酚结合从而降低了总酚含量[25]。

2.3 超高压提取对蓝靛果冻干粉中花色苷含量的影响

图2 提取压力对花色苷含量的影响Fig.2 Effect of extraction pressure on the yield of total anthocyanins

图2 为压力对冻干粉样品中花色苷含量影响。图中花色苷含量随着压力的上高先增大后减小，400 MPa时花色苷含量明显高于其他5 组实验样品且差异显著（P＜0.05），含量达4.12 μg/mg。对照组、100 MPa组花色苷含量差异不显著（P＞0.05），说明压力小于100 MPa对促进花色苷的提取作用不大。与对照组相比，600 MPa压力条件下花色苷含量较少且差异显著（P＜0.05）。研究表明，蛋白质、淀粉等生物大分子对花色苷具有一定包埋作用，压力达到600 MPa蓝靛果中蛋白质、淀粉结构发生改变，这种变化很可能促进包埋反应导致花色苷在离心过程中损失，最终导致冻干粉中含量下降[26-27]。

2.4 超高压提取对蓝靛果冻干粉中VC含量的影响

图3 提取压力对VC含量的影响Fig.3 Effect of extraction pressure on the yield of vitamin C

如图3所示，经过计算得出在1～12 μg/mL质量浓度范围内的线性回归方程：A=0.023 1C＋0.064 0，R2=0.998 9，式中：C为VC质量浓度；A为吸光度。经过比较，冻干粉样品中对照组VC含量最高为27.14 μg/mg；100、200、500 MPa 3 组VC含量差异不显著（P＞0.05）。表明超高压处理会对蓝靛果VC会造成一定损失。VC、多酚、花色苷均为小分子物质，且都有抗氧化活性易与生物大大分子结合，推测造成VC损失现象的原因与多酚、花色苷损失相同，都是由于蛋白质、淀粉等生物大分子对小分子的包埋作用造成的损失，且生物大分子对VC的包埋易受压力的影响。

2.5 抗氧化活性的变化

2.5.1 清除ABTS＋·能力分析

图4 提取压力对清除ABBTTSS＋·能力影响Fig.4 Effect of extraction pressure on ABTS＋· scavenging capacity

图4 为不同条件下处理样品的清除ABTS＋•的能力，计算得出标准品在0.15～1.20 mmol/L范围线性回归方程A =－0.602 9X＋0.667 3，R2= 0.999 4，式中：X为标准品当量浓度/（mmol/L）；A为吸光度。图中得出超高压辅助提取抗氧化物清除ABTS＋•能力以400 MPa（0.37 mmol/L）为分界点先增大后降低，且都要比对照组高，各组清除ABTS＋•能力差异显著（P＜0.05）。说明超高压提取具有增强蓝靛果抗氧化物清除ABTS＋•能力的作用。

2.5.2 FRAP分析

图5 提取压力对FRAP值影响Fig.5 Effect of extraction pressure on FRAP value

图5 为各组样品的FRAP值，计算得出标准品在0.15～1.20 mmol/L线性回归方程：A = 0.0437X＋0.016，R2= 0.994 5，式中：X为标准品当量浓度/（mmol/L）；A为吸光度。与清除ABTS＋•能力具有相同的趋势，超高压辅助提取抗氧化物FRAP以400 MPa（0.84 mmol/L）为分界点先增大后降低，且都要比对照组高，各组FRAP值差异显著（P＜0.05）。说明超高压提取具有增强蓝靛果抗氧化物FRAP的作用。

2.5.3 清除DPPH自由基能力分析

图6 提取压力对DPPH自由基清除率的影响Fig.6 Effect of extraction pressure on DPPH radical scavenging capacity

图6 为各组清除DPPH自由基能力，并不像ABTS＋•清除能力和F R A P具有一定规律，清除率高低次序为：400 MPa＞600 MPa＞对照＞100 MPa＞300 MPa＞200 MPa＞500 MPa，其中400 MPa组（91.5%）、600 MPa组（88.4%）的抗氧化物提取溶液对DPPH自由基清除率均高于对照组，其他提取条件下的结果则低于对照组，各组实验结果差异显著（P＜0.05）。说明在400、600 MPa条件下超高压提取具有增强蓝靛果抗氧化物DPPH自由基清除率的作用。

2.6 蓝靛果细胞微观结构观察

通过透射电子显微镜观察超高压处理对蓝靛果细胞结构的影响，探究超高压处理提高蓝靛果抗氧化物提取量的原因。根据实验测定抗氧化活性，得出400 MPa超高压条件下提取蓝靛果物抗氧化活性总体最高，所以选取400 MPa为实验组，分别在放大1 000 倍和3 000 倍观察蓝靛果细胞结构。

图7 透射电子显微镜观察超高压处理后蓝靛果细胞结构Fig.7 Transmission electron micrographs of the cellular microstructure of Lonicera caerulea fruits after ultra high pressure processing

通过对比图7a1、b1可以看出，在放大1 000倍条件下观察未经过处理的蓝靛果细胞结构完整，细胞壁轮廓清晰，细胞内容物没有溢出，实验组细胞结构遭到破坏，细胞壁轮廓混乱，内容物溢出。对比图7a2、b2可以看出，对照组样品细胞壁结构紧实、纹路规整、连接紧凑，实验组样品细胞壁结构松散、纹路模糊、连接断裂。结果说明超高压处理可以破坏蓝靛果细胞和细胞壁结构使细胞内抗氧化物与溶剂充分接触，从而提高抗氧化物的提取量。

3 结 论

通过实验结果分析得出：在提取时间为15 min，辅助提取压力在300 MPa时抗氧化物粗提取量最高为85.2 mg/g；抗氧化物冻干粉中总酚、花色苷、VC含量分别在300、400 MPa和对照组中达最大，分别为136.48、4.12 μg/mg和27.14 μg/mg；抗氧化活性检测结果表明大多数经过超高压处理的实验组抗氧化活性要比没有经过处理的对照组高，在超高压为400 MPa时清除ABTS＋•能力、FRAP值、DPPH自由基清除能力均达到最大值分别为0.37、0.84 mmol/L和91.5%，利用SPSS 18.0软件对数据分析发现实验结果中大部分数据组差异显著，这说明超高压处理对蓝靛果中3 种抗氧化物提取量及总抗氧化活性具有显著影响。通过透射电子显微镜制片观察发现，蓝靛果细胞结构受超高压影响巨大，未经过处理的蓝靛果细胞结构完整，细胞壁轮廓清晰、结构紧实、纹路规整、连接紧凑，细胞内容物没有溢出；经过超高压400 MPa处理的实验组样品细胞结构遭到破坏，细胞壁轮廓混乱、结构松散、纹路模糊、连接断裂，内容物溢出。这说明超高压处理使蓝靛果细胞破碎，使得溶剂与抗氧化物可以充分接触，进一步从微观角度解释了超高压处理提高抗氧化物提取量的原因。

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Effect of Ultra High Pressure Processing on Yield and Antioxidant Activity of Lonicera caerulea Extracts

LI Xinyuan1, YAN Tingcai1, LI Bin1, LIU Sunwen2, SUN Xiyun1, WANG Yanqun1, ZHANG Qi1, HUO Junwei3, MENG Xianjun1,*
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. College of Food Science and Technology, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066600, China; 3. College of Horticulture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

This experiment studied the effect of ultra high pressure treatment on the yields of total antioxidants, phenol, anthocyanins and VC extracted from Lonicera caerulea fruits and the total antioxidant activity of Lonicera caerulea extracts, and also explored the relationship between cellular microstructure and the extraction yield of total antioxidants. Our results showed that the highest yield of total antioxidants of 85.20 mg/g fresh fruit weight was obtained using an extraction pressure of 300 MPa. The lyophilized extracts obtained at 300, 400 and 0 MPa had the highest contents of total phenols, anthocyanins and VC, which were 136.48, 4.12 and 27.14 μg/mg, respectively. The total antioxidants extracted at 400 MPa possessed the highest antioxidant capacity as indicated by the highest 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt radical (ABTS+·) scavenging capacity (0.37 mmol/L), ferric reducing ability of plasma (FRAP, 0.84 mmol/L) and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH) scavenging capacity (91.5%). Transmission electron microscopy images showed that 400 MPa treatment caused huge damage to the cellular structure of Lonicera caerulea, which could be helpful for the extraction of antioxidants. Signif i cant differences in anthocyanins and VC were observed among some of the groups tested but not among the others. This experiment has proved that ultrahigh pressure processing can promote disruption of Lonicera caerulea fruit cells, being helpful for enhanced solvent extraction and activity of antioxidants.

Lonicera caerulea; ultra high pressure; antioxidant; cellular structure

10.7506/spkx1002-6630-201703020

TS209

A

1002-6630（2017）03-0119-06

2016-03-29

辽宁省高等学校优秀人才支持项目（LJQ2014068）；公益性行业（农业）科研专项（201303073-04）；沈阳农业大学天柱山英才项目（2014）

李新原（1991—），男，硕士研究生，研究方向为浆果深加工及功能食品开发。E-mail：497084602@qq.com

*通信作者：孟宪军（1961—），男，教授，博士，研究方向为天然活性成分和功能性食品。E-mail：mengxjsy@126.com

李新原, 颜廷才, 李斌, 等. 超高压与超声波对蓝靛果多酚提取及抗氧化活性的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(3)： 119-124. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703020. http：//www.spkx.net.cn

LI Xinyuan, YAN Tingcai, LI Bin, et al. Effect of ultra high pressure processing on yield and antioxidant activity of Lonicera caerulea extracts[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 119-124. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703020. http：//www.spkx.net.cn