李月双,姚 静,谢婷婷,潘 杰,李沛军,陈从贵*
(合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽 合肥 230009)
超高压对肌球蛋白-抗性玉米淀粉混合凝胶特性的影响
李月双,姚 静,谢婷婷,潘 杰,李沛军,陈从贵*
(合肥工业大学食品科学与工程学院,安徽 合肥 230009)
以添加质量分数0.6%抗性玉米淀粉(resistant corn starch,RCS)的鸡胸肉肌球蛋白(myosin,M)混合(M-RCS)体系为研究对象,考察超高压(ultra high pressure,UHP)处理(100~400 MPa,10 min)对该体系凝胶保水性(water holding capacity,WHC)和硬度的影响;并通过分析M-RCS体系表面疏水性、活性巯基含量、流变特性及凝胶水分子横向弛豫时间的变化,探讨其凝胶特性的变化机制。结果表明:M-RCS凝胶的WHC随着压力的增大(100~400 MPa)而显著增加(P<0.05),硬度则显著降低(P<0.05);UHP通过增加M-RCS体系的疏水基团和活性巯基数量,减小其储能模量G′,改变其黏弹性tanδ,缩短凝胶内部水分子弛豫时间T22和T23,减弱体系内水分的流动性,进而改变了凝胶的WHC和硬度。实验结果可为低脂、高膳食纤维肉制品的开发提供理论依据。
超高压;抗性玉米淀粉;肌球蛋白;凝胶品质特性
抗性淀粉是一类低热量、类似膳食纤维的变性淀粉,可促进人体健康[1-2],具有降低血清胆固醇、调节血糖、预防结肠癌等生理功能[3-5]。抗性淀粉应用于肉与肉制品,还可改善质构、保水等品质特性[6],并可提高其冻融稳定性[7]。肌球蛋白(myosin,M)既是肌肉中含量最多也是形成凝胶的蛋白质,其凝胶保水性(water holding capacity,WHC)和硬度直接影响肉制品的质量[8]。
超高压(ultra high pressure,UHP,压力>100 MPa)处理是一种非热加工技术,具有操作方便、作用时间短、物料受压均匀等优点[9];室温条件下可形成杀菌、钝化酶活和延长货架期等作用,且对肉制品营养品质和感官特性无显著影响[10]。邱志敏等[11]研究发现,UHP(200~400 MPa)可能通过使肉糜中肌原纤维蛋白变性及强化盐桥作用,或通过电致伸缩作用破坏二价阳离子与蛋白质之间的键合作用,显著增强了肉糜-变性淀粉的保水和质构特性(硬度、咀嚼性)。Chen Xing等[12]发现,UHP促使M变性、展开,活性基团(活性巯基、疏水基团)增多,增加了M与多糖的聚集作用,并由此改变M-多糖的凝胶微观结构,增强了凝胶结构束缚水的能力,致使M-多糖混合凝胶的WHC增加、硬度降低。史可夫等[13]研究表明,UHP还可通过增加M-海藻酸钠(多糖)-氯化钙混合凝胶体系内部的活性巯基含量,强化混合体系内部的疏水作用,弱化海藻酸钠和氯化钙对M凝胶的增强作用,降低了M的热凝胶能力以及凝胶网络结构的蛋白质聚集程度,进而引起凝胶保水性的增加和硬度的减弱。然而,UHP影响M-抗性淀粉混合体系凝胶特性的研究鲜见文献报道。
本研究以添加抗性玉米淀粉(resistant corn starch,RCS)构成M-RCS混合体系为对象,研究UHP对该体系凝胶特性(保水性和硬度)的影响,并探讨其变化机制,为UHP技术处理M结合RCS在低脂、功能肉制品中的开发应用提供理论指导。
1.1 材料与试剂
原料:鸡胸肉 市售;RCS 南通云峰淀粉有限公司。
氯化镁、氯化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、焦磷酸钠、乙二胺四乙酸二钠 国药集团化学试剂有限公司;二硫苏糖醇、曲拉通X-100、三磷酸腺苷二钠、8-苯胺基-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid hydrate,ANS) 生工生物工程(上海)股份有限公司;5,5’-二硫代-2-硝基苯甲酸(5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB) 阿拉丁试剂有限公司;所有试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
BD(C)-69冷藏柜 青岛澳柯玛股份有限公司;BC/BD-241GS冰柜 青岛海尔集团公司;GL-21M高速离心机 湖南湘仪离心仪器有限公司;DS-1高速组织捣碎机 上海越磁电子科技有限公司;FA25高剪切乳化机 上海弗鲁克流体机械制造有限公司;HPP.L2B 600MPa/0.6L超高压试验台 天津华泰森淼生物科技有限公司;TA-XT Plus质构仪 英国Stable Micro System公司;HH-2数显水浴锅 江苏金坛市环宇科学仪器厂;HR-3型流变仪 美国TA公司;PQ001纽迈台式脉冲核磁共振仪 上海纽迈电子有限公司;Power wave全波长扫描酶标仪 美国Bio-Tek公司。
1.3 方法
1.3.1 M提取
剔除鸡胸肉中可见脂肪与结缔组织,切碎、称质量约300 g;参照Zhou Yanzi等[14]的方法提取M;并用0.6 mol/mL氯化钾磷酸盐缓冲液(pH 6.5)将M质量浓度标准化到20 mg/mL。为防止M变性,所有操作在0~4 ℃环境下进行。
1.3.2 M-RCS溶胶制备
向150 g的M溶液(20 mg/mL)中加入质量分数0.6% RCS,在4 ℃条件下缓慢搅拌20 min,至完全溶解,在冰箱中(约4 ℃)静置过夜(约12 h),形成M-RCS混合溶胶。
1.3.3 UHP处理条件
将上述M-RCS混合溶胶缓慢注入到聚乙烯袋(长25 cm、宽18 cm)内,真空包装、密封;再将聚乙烯袋装入另一聚乙烯袋内,并注入约4 ℃的冷水,真空密封后进行UHP。压力水平设为0.1(未加压)、100、200、300、400 MPa,保压时间10 min,加压介质温度20 ℃。样品加压前后均需置于冰袋中保存,受压的M-RCS溶胶冰浴保存约12 h后,供热凝胶处理或检测。
1.3.4 M-RCS凝胶制备
称取受压后M-RCS混合溶液(10±0.3) g,置于10 mL小烧杯(Ф27 mm×35 mm)内,用保鲜膜封口;放入20 ℃水浴中恒温10 min,然后以平均2 ℃/min的升温速率,加热至80 ℃后保温30 min;取出小烧杯,冰水浴冷却10 min,于4 ℃条件下冷藏12 h,得到M-RCS凝胶,供检测。
1.3.5 WHC测定
参照Zhou Yanzi等[14]的方法,并稍微修改。取出M-RCS凝胶样品,置于质量m0离心管中,凝胶与离心管总质量为m1,在4 ℃、1 000×g条件下离心10 min,离心后用吸水纸除去管内与凝胶表面的水分,称质量m2。检测重复7 次。WHC按式(1)计算。
1.3.6 凝胶强度测定
利用TA-XT Plus质构仪GMIA程序测定M-RCS凝胶强度,单位为g。测定参数为:探头选用P/0.5,测前速率1.50 mm/s,测中速率1.00 mm/s,测后速率1.00 mm/s,穿刺距离4 mm,触发力5 g。检测重复7 次。
1.3.7 流变性质测定
参照Verbeken等[15]的方法并作修改。流变仪采用振荡模式,检测参数为:平行板直径40 mm,狭缝1 mm,应变2%,振动频率0.1 Hz。测试过程包括升温和降温2 个阶段,升温速率2 ℃/min,温度变化范围为20~80 ℃;降温速率4 ℃/min,温度变化范围为80~20 ℃。分别记录升温、降温过程中的储能模量(G’)、相位角正切值(tanδ)的变化。每个处理平行测定3 次。
1.3.8 表面疏水性测定
参照Chen Xing等[12]方法,将M-RCS溶胶用0.6 mol/mL氯化钾-磷酸盐缓冲液(pH 6.5)稀释到蛋白质质量浓度1.0 mg/mL,取4 mL样品稀释液,加入20 μL 15 mmol ANS(磷酸盐缓冲液,pH 6.5),充分振荡混合均匀,25 ℃反应20 min,吸取200 μL反应液于酶标板内,在激发波长380 nm、发射波长470 nm条件下检测其荧光强度。每个处理平行测定5 次。
1.3.9 表面活性巯基含量测定
参照Chen Xing等[12]方法,取1.3.8节蛋白质质量浓度1.0 mg/mL样品稀释液4 mL,加入10 mmol/L DTNB溶液50 μL,充分振荡混合均匀,避光反应20 min,以添加50 μL 10 mmol/L DTNB的4 mL 0.6 mol/mL氯化钾-磷酸盐缓冲液作为对照,在412 nm波长处测定其吸光度A412nm。检测重复5 次。巯基含量计算见公式(2):
式中:A412nm为吸光度;D表示稀释倍数;C蛋白为M质量浓度/(mg/mL)。
1.3.10 低场核磁自旋弛豫时间测定
参照Han Minyi等[16]的方法并作修改。采用低场核磁共振技术检测,在微型核磁共振成像仪上进行,约2~4 g样品放入直径25 mm核磁管中,质子共振频率为18.169 MHz,磁体强度0.43 T,自旋-自旋弛豫时间T2用Carr-Purcell-Mebiboom-Gill(CPMG)序列进行测量,其中回波时间(TE)为400 μs,15 000个回波,重复扫描4 次,重复等待时间8 000 ms,得到指数衰减图形使用SIRT算法拟合得到T2谱图。
1.4 数据处理
采用Excel 2007软件进行数据分析;采用t检验进行显著性分析,显著性水平取P<0.05;采用Origin 8.5软件作图。
2.1 UHP对M-RCS凝胶品质特性的影响
2.1.1 UHP对M-RCS凝胶WHC的影响
图1 UHP对M-RCS凝胶WHC的影响Fig.1 Effect of UHP on WHC of M-RCS gels
如图1所示,未受压(0.1 MPa)时,添加的RCS可提高M凝胶的WHC;而UHP(100~400 MPa)可进一步提高M-RCS凝胶的WHC(P<0.05),且随着压力的升高,凝胶WHC增加显著。任云霞等[17]通过实验观察到UHP(100~400 MPa)可提高鸭肉肌原纤维蛋白-变性淀粉混合体系凝胶的WHC,且保水性随着压力的增大而提高;推断400 MPa以下的UHP会导致肌原纤维蛋白的解聚,从而增大了蛋白的溶解度,促进了变性淀粉与蛋白的结合,进而提高了WHC。
Chen Xing等[12]发现,UHP可能通过改变M-卡拉胶体系凝胶中的氢键数量、水分子流动性以及微观结构等来提高其WHC。还有研究表明,UHP可导致淀粉膨胀率的增加[18],而对于受压M-RCS体系,RCS也可能吸水膨胀,使得M-RCS凝胶网络结构中截留更多的水,导致凝胶WHC增加。
2.1.2 UHP对M-RCS凝胶硬度的影响
图2 UHP对M-RCS凝胶硬度的影响Fig.2 Effect of UHP on gel strength of M-RCS gels
由图2可见,与未受压(0.1 MPa)的M-RCS凝胶相比,UHP(100~400 MPa)会显著降低凝胶的硬度(P<0.05),且随着压力水平的提高,硬度依次降低;但压力超过300 MPa时,增压对硬度的影响不显著(P>0.05)。此外,添加的RCS可显著增强未受压(0.1 MPa)M凝胶的硬度(P<0.05),由此说明,UHP与RCS对M凝胶硬度的影响具有互补作用。
有研究认为,UHP导致的蛋白质变性,会在随后的热诱导凝胶化过程中降低凝胶网络结构间的交联程度,致使其硬度下降[12,19]。Pérez-Mateos等[20]认为,UHP可使肉蛋白充分变性展开,并与多糖发生更强烈的作用而形成更大的聚合物,而在卸压后的热诱导凝胶过程中,这类聚合物会对蛋白凝胶的形成产生阻碍作用,导致肉糜凝胶硬度的下降。Chen Xing等[12]认为,蛋白凝胶网络结构的形成主要依赖于蛋白质的变性、展开和聚集,且凝胶化程度与蛋白变性和聚集的速率有关,UHP会限制蛋白-多糖体系中蛋白的变性和聚集,弱化了蛋白与蛋白、蛋白与多糖间的作用,导致其凝胶硬度下降。而邱春强等[21]发现,UHP通过使肉蛋白变性,可显著提高盐溶蛋白-瓜尔胶凝胶的硬度和强度。也有学者对受压肉糜-变性淀粉混合体系研究发现,100~500 MPa的压力可使肉蛋白充分变性,形成致密、精细的凝胶网络结构,从而提高了凝胶的硬度和强度[11]。可见,受压体系不同,结果可能各异,UHP影响肉蛋白凝胶质构的本质还有待进一步研究。
2.2 UHP对M-RCS混合溶胶表面疏水性与活性巯基的影响
蛋白质三级和四级结构的稳定由其侧链间形成的氢键、疏水作用、静电作用、范德华力和二硫键等维持[20]。表面疏水性、活性巯基含量的变化将引起蛋白质三级结构的改变,并导致蛋白质功能性质的变化[15]。如图3所示,与未受压组(0.1 MPa)比较,UHP(100~400 MPa)能显著增加M-RCS体系的表面疏水性和活性巯基含量(P<0.05);且随着压力的增加,表面疏水性依次增强,活性巯基含量依次增多。
图3 UHP对M-RCS体系表面疏水性(A)和活性巯基含量(B)的影响Fig.3 Effect of UHP on surface hydrophobicity (A) and reactive sulfhydryl group content (B) of M-RCS gels
Alvarez等[22]研究指出,UHP会提高蛋白质分子的展开程度,从而使ANS分子易于进入蛋白质的疏水核心区域,引起荧光强度的增强(疏水性变大)。Zhang Hongkang等[23]认为,受压蛋白巯基数量的增多,可能是由二硫键(S—S)的断裂还原引起的。而Cao Yingying等[24]研究认为,由于UHP提供的能量有限(10 000 MPa的压力仅可提供约8.37 kJ/mol的能量),远低于S—S键断裂需要的能量(213.30 kJ/mol),只会导致M分子结构的变化,使得蛋白分子暴露出更多的内部活性巯基,从而导致表面活性巯基数量的增加。由此可以推测,UHP(100~400 MPa)诱导的M分子变性展开,暴露了更多的内部疏水残基和巯基,进而显著提高了M-RCS体系的表面疏水性和活性巯基含量(图3)。
Chen Xing等[12]研究认为,UHP促使蛋白-多糖体系中活性巯基和疏水基团数量增加,增强了体系内的氢键和疏水作用,阻碍了凝胶中的水分流动,提高了WHC。而受压M-RCS体系中活性巯基和疏水基团含量的增加,可能是导致其WHC增加(图1)的诱因。而UHP诱导的M分子变性展开,也可能会降低受压M-RCS体系在热凝胶化过程中蛋白分子之间交联程度,从而导致其凝胶硬度的下降(图2)。
2.3 UHP对M-RCS混合溶胶流变特性的影响
图4 UHP对M-RCS体系升温(A)和降温(B)过程中储能模量(G’)的影响Fig.4 Effect of UHP on storage modulus (G’) of M-RCS gels during heating (A) and cooling (B)
储能模量G’值反映黏弹性体系中弹性部分,数值越大,弹性部分越强。如图4A所示,在20~80 ℃的热诱导凝胶过程中,UHP会导致M-RCS体系G′值的显著减小,而且在100~300 MPa范围内,随着压力的增大,减小的程度越显著。未受压(0.1 MPa)的M-RCS溶胶在热诱导凝胶过程中出现两个峰,一个为50 ℃左右的凝胶“形成”阶段,该阶段是由于M分子的头部和铰链部分变性、聚合引起,随后M分子尾部发生变性而进入凝胶“减弱”阶段;另一个为66 ℃左右的凝胶“增强”阶段[25]。100~200 MPa的UHP可使M-RCS体系的凝胶“形成”峰温度发生右移,并在凝胶“减弱”阶段后,G’值虽持续增加,但第2个峰消失;当压力增至300~400 MPa时,受压M-RCS体系的G′值缓慢增加,而两个峰均完全消失。有研究表明,UHP可阻碍蛋白质在随后热诱导凝胶过程中的进一步变性和聚集,并对蛋白质起到一定的保护作用[26]。Cao Yingying等[24]在研究UHP对兔M凝胶机理时认为,活性巯基含量和表面疏水性的增加,预示着蛋白质变性程度增大,影响了热诱导凝胶的质构和黏弹性。
由图4B可知,受压M-RCS体系的G’值呈现随温度降低而增加的变化趋势,与未受压组(0.1 MPa)的变化趋势基本相同,表明受压与非受压M-RCS体系在冷却过程中,均能进一步促进三维凝胶网状结构的形成,表现出凝胶弹性的增加。但受压体系G’值增加的幅度却随着UHP压力的提高而减弱;且在温度降到20 ℃时,M-RCS体系的G’值依然显示出随着压力增加而减小的变化规律,这与UHP影响M-RCS体系凝胶硬度的结果(图2)相一致。此外,在压力超过200 MPa时,M-RCS体系的G’值曲线发生了微小变化,在67 ℃左右处出现了一个坡峰。这可能与UHP诱导的RCS颗粒吸水膨胀能力增强[18]有关;压力越高,RCS的变性程度可能越大,由此影响了M-RCS体系后续热凝胶化过程的特性表现,显示出凝胶弹性的波动。
图5 UHP对M-RCS体系升温过程中ttaannδ的影响Fig.5 Effect of UHP on tanδ of M-RCS during heating
δ值反映了蛋白质由黏性溶胶向弹性凝胶的转变。如图5所示,UHP改变了升温过程中M-RCS体系的tanδ。与未受压组(0.1 MPa)相比,100 MPa压力处理后,tanδ曲线形状没有显著变化,表明此压力对M-RCS体系的黏弹性影响较小,这也证明了相同条件下M-RCS体系G’值变化不显著的原因(图4A)。以前的研究也发现类似的现象[12]。当压力≥200 MPa时,tanδ线形发生较大幅度的波动,表明UHP诱导的黏弹性变化较大。此外,受压M-RCS体系在20 ℃时均表现出更强的黏性特征,其原因可能是受压M-RCS体系中M分子的变性、展开和RCS分子的变性,增强了M-RCS体系内部的相互作用,使得M-RCS体系变得更加黏稠。
2.4 UHP对M-RCS凝胶弛豫时间的影响
图6 UHP对M-RCS凝胶弛豫时间(T2)分布的影响Fig.6 Effect of UHP on T2relaxation time distribution of M-RCS gels
低场核磁共振中的弛豫时间T2反映体系中水分子自由度。由图6可知,在0~10 000 ms的T2分布上,T2出现3 个峰,分别对应于结合水T21(0~10 ms)、不易流动水T22(100~700 ms)和自由水T23(1 000~3 000 ms)。这类似于前期在M-多糖混合凝胶体系中所观察到的水分分布结果[14]:T21(3.05~14.17 ms)、T22(151.99~464.15 ms)和T23(1 232.85~1 873.82 ms),其差异可能与选择的磁体强度及核磁共振参数不同有关。与未受压组(0.1 MPa)相比,受压M-RCS凝胶体系中T22和T23对应的水分子T2峰值均发生了左移现象,即随着UHP压力的增大,T22值依次显著缩短(P<0.05);而T23虽然在100~300 MPa范围内无显著变化(P>0.05),但是当压力达到400 MPa时,T23值也显著缩短(P<0.05),结果见表1,反映出UHP会增强M-RCS凝胶体系对水分子的束缚能力,由此提高了WHC(图1)。
表1 UHP对M-RCS凝胶弛豫时间(T2222和T2233)的影响Table1 Effect of UHP on spin-spin relaxation times (T2222aanndd T2233)) ooff M-RCS ggeellss
此外,从T2对应的峰面积看(图6),所有样品中结合水对应的峰面积占比很小,表明其含量很低;而随着压力的提高,受压(100~400 MPa)凝胶中T22对应的峰面积占比减小,T23对应的峰面积占比却反而增大,反映出UHP会导致凝胶体系内自由水的含量增加,不易流动水的含量减少。这种水分分布现象与WHC之间的关系还有待进一步解析。
仪淑敏等[27]在观察含有淀粉的UHP鱼糜凝胶时发现,在100~400 MPa范围内,随着压力的增大,体系中蛋白质或淀粉大分子中亲水基团暴露增多,增加了水分子与之结合的机会,从而导致凝胶中对应不易流动水的T22缩短。Chen Xing等[12]也发现,UHP促进了M分子与卡拉胶之间的聚集,导致体系凝胶三维结构中空隙的减小,减弱了水分子的流动性,缩短了T22时间。很多研究表明,凝胶体系中水分子T2与其WHC有直接关系[28-29],M-RCS体系凝胶的水分子T2的减小,表明体系中水分子的流动性变弱,M-RCS体系凝胶三维结构截留水的能力增强,最终导致WHC的增加(图1)。
UHP会导致溶胶体系内部M和RCS分子的变性,使得M分子暴露出更多的活性基团,如疏水基团和活性巯基,增强了疏水作用和氢键作用,并在随后热凝胶化过程中形成了聚集程度更大的凝胶结构,可截留更多的水分;同时,UHP还导致了M-RCS体系凝胶对水分的束缚能力增强,流动性变弱,进而提高了M-RCS体系凝胶的WHC。这些变化以及受压后M分子间距增大、RCS膨胀引起的位阻作用增强,导致M-RCS热诱导凝胶结构的交联程度降低、凝胶能力下降、黏弹性减弱,从而降低了UHP混合凝胶的硬度。
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Effect of Ultra High Pressure Processing on Gel Properties of Chicken Breast Myosin Containing Resistant Corn Starch
LI Yueshuang, YAO Jing, XIE Tingting, PAN Jie, LI Peijun, CHEN Conggui*
(School of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)
The effect and mechanism of ultra high pressure (UHP) processing (100-400 MPa for 10 min) on the waterholding capacity (WHC) and hardness of chicken breast myosin gel containing 0.6% (m/m) resistant corn starch (RCS) (M-RCS) were investigated. The results showed that UHP at 100-400 MPa could significantly increase the WHC of M-RCS gels and decrease the gel hardness in a pressure-dependent manner (P < 0.05). UHP could signif i cantly increase the hydrophobic groups and reactive sulfhydryl contents of M-RCS system (P < 0.05), thereby reducing storage modulus (G’), changing viscoelasticity tanδ and shortening the transverse relaxation time T22and T23(P < 0.05) to result in a higher WHC value and a lower hardness of the gel. UHP treatment is benef i cial to the development of low-fat and high-f i ber meat products.
ultra high pressure; resistant corn starch; myosin; gel properties
10.7506/spkx1002-6630-201703001
TS251.51
A
1002-6630(2017)03-0001-06
李月双, 姚静, 谢婷婷, 等. 超高压对肌球蛋白-抗性玉米淀粉混合凝胶特性的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(3): 1-6. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201703001. http://www.spkx.net.cn
LI Yueshuang, YAO Jing, XIE Tingting, et al. Effect of ultra high pressure processing on gel properties of chicken breast myosin containing resistant corn starch[J]. Food Science, 2017, 38(3): 1-6. (in Chinese with English abstract)
10.7506/ spkx1002-6630-201703001. http://www.spkx.net.cn
2016-03-23
国家自然科学基金面上项目(31271893)
李月双(1989—),男,硕士研究生,研究方向为肉制品加工。E-mail:836954726@qq.com
*通信作者:陈从贵(1963—),男,教授,硕士,研究方向为肉制品加工及副产物综合利用。E-mail:ccg1629@163.com