乳清分离蛋白凝胶VC释放过程的动力学

和劲松，任 艳，何莲君，李 娟，董文明*

（云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201）

乳清分离蛋白凝胶VC释放过程的动力学

和劲松，任 艳，何莲君，李 娟，董文明*

（云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201）

本研究以VC作为食品功能性成分模型，利用热诱导使其封装于乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）凝胶内，通过静态释放实验和动力学分析，探讨释放介质pH值、温度、载药量、释放液离子浓度对WPI凝胶中VC释放特性的影响，并建立VC在WPI凝胶中释放过程的动力学模型。实验结果表明，VC在WPI凝胶中累计释放分数的变化与蔗糖的动力学模型不同，不遵循已有的Korsmeyer-Peppas模型X＝Ktn，而遵循本研究建立的修正模型：X＝Ktne-k’t，且相关系数R2在0.95～0.99之间。VC的释放速率，随pH值、温度以及释放液离子浓度的增加不断增大，随载药量的增加而不断减小。研究表明，WPI凝胶具有环境应答性，以其为载体的VC释放过程受环境的pH值、温度、释放液离子浓度等因素影响。因此，通过调节释放体系的pH值、温度、载药量、释放液离子浓度可以达到控制VC释放的目的。

乳清分离蛋白；凝胶；释放特性；动力学模型

蔗糖分子中不存在半缩醛基，不显示变旋现象，没有还原性。VC是一个烯二醇的内酯，类似邻苯二酚的结构，所以在性质上具有强还原性、易氧化[1]。本研究将食品功能成分VC与乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）混合后制成凝胶，旨在以WPI凝胶为载体的VC功能凝胶食品释放调控系统的开发。WPI是干酪生产过程的副产品乳清经过特殊工艺浓缩精制而得的一类蛋白质[2-5]。WPI不仅是一种营养价值极高的蛋白食品，且拥有较好的凝胶形成特性[6-8]，WPI凝胶在微观尺度上存在一个空间网络构造[9-11]，即微构造，可作为功能性成分的载体[12-15]。VC作为一种高效抗氧化剂，可清除生长代谢产生的活性氧基团及自由基，保护细胞免遭氧化损害。研究发现将功能性成分包埋于蛋白凝胶或凝胶微粒中，不仅可以保护其生物活性，而且能够调节释放速率[16-18]、提高释放靶向性[19-21]、增强体细胞免疫应答[22-23]，从而有效提高各类活性物质的生物利用率。Chen Lingyun等[24]利用WPI冷凝胶形成的颗粒或网络结构在替代脂肪和提高禽肉的黏弹性方面都收到了很好的效果，而且对VE、益生菌和其他生物活性物质也有较好的包埋效果和携带作用[25-26]。近年来关于WPI凝胶的研究多集中在pH值、离子浓度及温度等对凝胶形成的影响方面[27-28]，关于以WPI凝胶为载体的食品功能成分的释放特性的研究鲜见报道。

本研究中以VC作为食品功能性成分模型，利用热诱导使之封装于WPI凝胶内，通过实验探讨释放介质的pH值、温度、离子浓度、载药量等因素对VC释放特性的影响及对其动力学机理进行研究，以期为WPI在新型凝胶食品的开发、功能性成分的无损封装等技术领域的应用提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清分离蛋白粉，蛋白质含量＞95% 美国Le Sueur Cheese公司；VC、可溶性淀粉、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、冰乙酸、碳酸钠、氢氧化钠 天津市风船化学试剂科技有限公司；碘化钾 上海申博化工有限公司；碘 西陇化工股份有限公司；无水乙酸钠广东光华化学厂有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

PL303型电子天平、FE20型实验室pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；WFJ7200型可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；601超级恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂；TGL-16C高速离心机上海安亭科学仪器厂；XK96-A快速混匀器 姜堰市新康医疗器械有限公司；TTL-10B超纯水器 北京同泰联科技发展有限公司；B11-1恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 VC封装的WPI热凝胶制备

准确称取16 g WPI和所需的VC用量（0.00～0.24 g）放入烧杯中，加入100 mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌使其混匀后用磁力搅拌器搅拌至完全溶解分散，用自封袋密封，4 ℃冰箱放置12 h后将WPI与VC混合分散溶液在（85±0.1） ℃恒温水浴锅中加热25 min制成WPI凝胶，放在冰水混合物中迅速冷却后，用刀片切分成1 cm3正方体凝胶块。

1.3.2 静态释放体系的建立

为了探讨释放环境（磷酸盐缓冲液）对WPI凝胶释放特性影响因素及其动力学规律进行研究，按表1建立pH值、温度、离子浓度、凝胶载药量等的静态释放体系。

表1 静态释放体系的建立Table1 Establishment of static release systems

1.3.3 VC定量标准曲线绘制

参考王美荣[29]的方法，向1 mL VC标准溶液中加入5 mL淀粉溶液，用碘溶液滴定至溶液呈蓝色，记录滴定体积，平行测定3 次，取平均值，绘制标准曲线，得线性回归方程Y＝119.78X－0.248，R2＝0.999。

1.3.4 释放液中VC质量浓度的测定

取1 mL释放液，按1.3.3节方法记录滴定体积，参照VC定量标准曲线中的计算方法，测定VC质量浓度。

1.3.5 动力学参数分析方法

为分析WPI凝胶释放过程的动力学规律，本研究拟采用式（1）所示，Korsmeyer-Peppas模型进行动力学拟合分析。

Korsmeyer-Peppas模型是分析活性成分在多孔材料中释放最为理想的模型[30]。X是累计释放分数/%；K为动力学常数/min－n（即释放速率）；t为释放时间/min；n是扩散常数（无量纲），由n来决定动力学机理：当n≤0.45时，活性成分释放机理符合Fick扩散机理；当0.45＜n＜0.89时，符合非Fick扩散机理；当n≥0.89时，符合以骨架溶蚀为主的机理。

其中：

式中：mt是时间t时的释放总量/（μg/mL）；m0是释放所用凝胶块的载药量/（mg/mL）；Atotal是凝胶的总载药量/（mg/mL）；Vdisk是释放所用凝胶块的体积/mL；Vtotal是最初配制WPI溶液的体积/mL。通过不同时刻t，对释放液中活性成分质量浓度进行测量，可以求得式（1）所示累积释放分数X（无量纲），用式（1）对累计释放分数进行拟合分析可得释放过程动力学参数。

1.4 数据统计分析

应用Origin 8.0软件进行拟合分析，Excel 2007软件进行显著性分析，显著性水平选取P＜0.05，结果以±s表示。

2 结果与分析

2.1 WPI凝胶VC释放饱和时间与质量浓度的关系

图1 VC释放质量浓度在WPI凝胶中随时间的变化Fig.1 Time-course curve of vitamin C release from WPI gel

WPI凝胶中VC的释放质量浓度随释放时间的变化如图1所示，随着时间的延长，释放质量浓度呈先上升后下降的变化趋势，存在一个饱和点。

图2 VC释放过程中饱和时间、饱和质量浓度的计算Fig.2 Calculation of saturation time and saturated concentration of vitamin C release

为了计算释放质量浓度的饱和点，通过线性拟合对VC释放质量浓度上升阶段和下降阶段添加线性趋势线（图2）。根据两条趋势线的交点，线性方程解出X值即为释放饱和时间，Y值即为饱和质量浓度。

2.2 不同pH值对WPI凝胶释放特性的影响及动力学分析

由图3可知，不同pH值释放介质条件下，随着释放时间的延长，VC释放质量浓度也不断增加，当达到饱和后，VC释放质量浓度随着释放时间的延长开始逐渐降低。

图3 pH值对WPI凝胶释放特性的影响Fig.3 Effect of pH on release characteristics of vitamin C from WPI gel

对不同pH值条件下VC释放的饱和时间、饱和质量浓度、释放比率的分析结果见表2。

表2 不同pH值条件下VC释放特征参数Table2 Release characteristic parameters of vitamin C under different pH conditions

由表2可知，pH 2.0～8.0范围内，随着pH值的升高，VC释放的饱和时间逐渐增加；饱和质量浓度以及释放比率在pH值为6.0时达到最大；pH值在7.0和8.0时，VC释放的饱和质量浓度和释放比率逐渐降低。pH 2.0～6.0范围内，随着pH值的增大，VC的释放比率逐渐增大。这可能是由于凝胶在pH 6.0的缓冲溶液中的溶胀程度比在pH 2.0的缓冲溶液中的大得多，溶胀程度大的凝胶网络上的间隙比较大，有利于药物从凝胶中释放出来[31-32]。因此凝胶中VC的释放速率较高。pH 8.0时释放比率下降，可能是因为VC是不稳定物质，在溶液中的溶解度受pH值的影响比较大，在弱碱性的条件下容易氧化而遭到破坏[33]。

为了探讨VC释放过程的动力学机理，根据式（1）对不同pH值条件下VC的累计释放分数X进行拟合分析（表3）。

表3 不同pH值条件下VC释放的Korsmeyer-Peppas模型拟合结果Table3 Fitting of Korsmeyer-Peppas model for the release of vitamin C under different pH conditions

由表3可知，pH 2.0～8.0范围内相关系数R2最高只达到0.88。拟合结果表明，VC的释放不符合X＝Ktn这一动力学模型，这可能是由于VC类似邻苯二酚的结构，极易氧化，在释放过程中存在衰减现象造成的。

唐延甜[34]研究发现水溶性药物VC，由于自身的性质，在药物稳定释放后期阶段释放程度会有一定程度的减弱。根据衰减现象，本研究假设，VC的衰减速率与其质量浓度（C）成正比，即：

其中，k’是衰减动力学参数（无量纲）。对式（4）求解可得：

即：

式（6）中，C0是t＝0时的VC质量浓度，C/C0为衰减比率。根据式（6）对Korsmeyer-Peppas模型X＝Ktn进行修正，可得VC指数衰减模型：

式中：X是累计释放分数；n是扩散常数；t是释放时间/min；e是自然数。

根据式（7）对不同pH值条件下，WPI凝胶释放过程中VC质量浓度的衰减进行拟合分析见图4。

图4 不同pH值条件下VC释放过程动力学拟合Fig.4 Kinetic fi tting of the release of ascorbic acid under different pH conditions

如图4所示，各组实验数据与假设提出的模型拟合曲线基本吻合。动力学拟合参数如表4。

如表4所示，各组实验数据的相关系数R2均大于0.97。pH 2.0～6.0时，动力学参数逐渐增大，pH 6.0时达到最大值，pH 7.0～8.0时，动力学参数逐渐减小；pH 3.0～7.0条件下扩散常数0.45＜n＜0.89，符合非Fick扩散机理；pH值为2.0、8.0时，扩散常数n≤0.45，符合Fick扩散机理。随着pH值的升高，衰减常数先增大后减小。VC累计释放分数的变化遵循本研究修正模型即式（7）动力学模型。

表4 不同pH值条件下VC释放过程的修正模型动力学拟合结果Table4 Kinetic fi tting of modi fi ed model for the release of vitamin C under different pH conditions

郭帅等[35]研究发现VC在碱性环境条件下不稳定，在酸性环境条件下较稳定。VC释放过程的动力学常数随着pH值的改变而改变（表4），这可能是因为在凝胶状态，蛋白质二级结构会随pH值的改变而改变，导致WPI凝胶的流变学性质具有pH敏感性[36-37]，使得WPI凝胶变性和凝聚特性也随pH值的改变而改变，导致WPI凝胶的动力学也随pH值而改变。WPI等电点接近pH 5.0，在碱性范围，随pH值的增加，蛋白质分子表面电荷量增强，蛋白质与VC间的静电相互作用增强，对释放过程造成一定影响。张瑜等[38]研究释放介质pH值和离子强度对羧甲基魔芋胶小丸体外释药的影响，发现随释放介质pH值增加，丸粒的溶胀度和溶蚀度增加，小丸释药加快。

2.3 不同温度对WPI凝胶释放过程的影响及动力学分析

图5 温度对WPI凝胶释放特性的影响Fig.5 Effect of temperature on release characteristics of vitamin C fromWPI gel

由图5可知，随着温度的升高，VC的释放质量浓度逐渐增大，但10 min以后出现衰减趋势。

表5 不同温度条件下VC释放特征参数Table5 Release characteristic parameters of vitamin C from WPI gel under different temperatures

由表5可知，20～50 ℃时，随着温度的升高，VC释放的饱和时间逐渐缩短，饱和质量浓度以及释放比率逐渐增大。

热诱导凝胶的性质会随周围环境温度变化而改变。其温度响应性与凝胶网络中氢键的形成和离解有关，溶液温度升高时，氢键断裂导致凝胶网络疏松，凝胶溶胀，温度下降时，氢键形成凝胶收缩[39]。实验结果中，温度由4 ℃升高到50 ℃时，VC的释放饱和质量浓度逐渐增大，释放比率也显著增大。这可能是由于随着温度升高，作为载体的蛋白凝胶发生由亲水到疏水的转变引起凝胶“核-壳”结构被破坏，凝胶内核塌陷，在凝胶去溶胀的过程中，水分子携带着药物粒子一同被挤压出亲水层，导致载物释放量增大[40]。

表6 不同释放温度条件下VC释放过程动力学拟合结果Table6 Kinetic fi tting for the release of vitamin C under different temperatures

对不同温度下VC的释放过程按式（7）进行动力学拟合分析，结果如表6所示，VC释放过程的动力学常数，衰减常数k’都随着温度升高而逐渐增大，相关系数R2均达到0.99，且扩散常数0.45＜n＜0.89，符合非Fick扩散机理。

由表6可知，随着释放温度的升高，动力学常数K，衰减常数k’和扩散常数n都不断增大，可能是在更高的温度条件下，药物的分子热运动加快，药物能更快在释放介质和凝胶内部交换，所以药物的释放速率加快。释放速率常数增加是温度增加的结果。杨桔[41]研究发现，载药凝胶在37 ℃时的释药速率明显高于25 ℃时的释药速率，表现出显著的温度敏感性。潘婷婷[42]研究发现，40 ℃时的释放速率是20 ℃时的两倍。同时，当温度从20 ℃升高到40 ℃时，最大释放浓度也随之增大。

2.4 不同释放液离子浓度对WPI凝胶释放的影响及动力学分析

图6 释放液离子浓度对WPI凝胶释放的影响Fig.6 Effect of ion concentration in releasing liquid on the release of vitamin C in WPI gel

由图6可知，释放时间小于15 min时，VC的释放质量浓度随着释放液离子浓度的增加呈增大趋势。

表7 不同释放液离子浓度条件下VC释放特征参数Table7 Release characteristic parameters of vitamin C from WPI gel under different medium concentrations

由表7可知，随着释放液离子浓度的改变，VC释放的饱和时间也随之改变；随着释放液离子浓度的增加，饱和质量浓度与释放比率都不断增大，当释放液离子浓度达到0.15 mol/L以后，VC释放的饱和质量浓度与释放比率呈减少趋势。

表8 不同释放液离子浓度下VC释放过程动力学拟合结果Table8 Kinetic fi tting for the release of vitamin C under different medium concentrations

不同释放液离子浓度下VC的释放过程按式（7）进行动力学拟合分析，结果由表8可知，动力学拟合相关系数R2均达到0.99，在0.00～0.10 mol/L范围内，动力学常数，扩散常数和衰减常数总体上随着释放液离子浓度的增加而逐渐增大；当释放液离子浓度达到0.15 mol/L时，动力学参数反而逐渐下降，且扩散常数0.45＜n＜0.89，符合非Fick扩散机理。

凝胶的溶胀吸水主要与渗透压有关，释放介质的离子浓度高低会改变凝胶内部和外界的渗透压，从而改变凝胶的释放速率。在0.00～0.10 mol/L范围内，释放介质离子浓度的增加使得VC的释放速率增加，当释放介质离子浓度达到0.15 mol/L时，释放速率反而下降，显示出WPI凝胶具有较强的离子敏感性（表8）。水凝胶在释放介质离子浓度较低情况下有较大的溶胀率，此时凝胶网络具有较好的可扩展性，使得载物易于从凝胶内部释放出来。而随着释放介质离子浓度的逐渐增大，使得水凝胶中高分子链变得卷曲，分子链的卷曲增强了分子内疏水缔合，大分子链间相互作用增强，使分子链更为卷曲，因而凝胶与水分子之间的相互作用力逐渐减小，凝胶的溶胀率逐渐下降，导致载物不容易从凝胶中释放出来，从而释放速率下降[43-44]。Jalil等[45]用羟丙基甲基纤维素（hydroxypropyl methylcellulose，HPMC）作为释放材料研究释放介质中释放液浓度对茶碱释放浓度的影响，发现增加介质的释放液浓度，茶碱的释放呈指数增加。

2.5 不同载药量对WPI凝胶释放过程的影响及动力学分析

图7 载药量对WPI凝胶释放特性的影响Fig.7 Effect of drug loading on release characteristics of vitamin C from WPI gel

由图7可知，在相同的释放时间条件下，VC的释放质量浓度随着载药量的增加而增大，当10 min或15 min时VC释放质量浓度饱和后，其值逐渐降低。

表9 不同载药量条件下VC释放特征参数Table9 Release characteristic parameters of vitamin C from WPI gel under different drug loading conditions

不同载药量条件下VC释放的饱和时间、饱和质量浓度、释放比率由表9可知，VC释放的饱和时间先增长后缩短；饱和质量浓度随着载药量的增加而逐渐增大，而释放比率则随着载药量的增加而逐渐减小。结果中，随着VC质量浓度增加，VC的释放比率降低，这是因为VC的质量浓度越大，溶液越黏稠，形成凝胶的结构越致密，对药物的包埋作用越强，所以药物从凝胶中释放出来的速率就越慢，释放比率就会越低。随着载药量增加，载药释放速率逐渐下降，这可能是因为药物质量分数越大，耐水性越强，交联密度越高，凝胶的骨架越紧密，溶胀性变小，使进入微球的水量减少，药物的释放速率减慢[46]。

由表10可知，不同载药量下VC释放的动力学拟合的相关系数R2均达到0.99，VC释放的动力学常数随着载药量的增加逐渐减小；衰减常数和扩散常数也随着载药量的改变而改变。扩散常数0.45＜n＜0.89，符合非Fick扩散机理。

表10 不同载药量条件下VC释放过程动力学拟合结果Table10 Kinetic fi tting for the release of vitamin C under different drug loading conditions

随着载药量的增加，动力学常数逐渐减小。这可能由于在低载药量时内部凝胶与外部释放介质质量浓度梯度很大，水分子迅速渗透进入微球内部，凝胶的吸水膨胀使得凝胶体积不断增大，药物便从中释放出来；而高质量浓度载药量时，由于凝胶内部和释放介质存在明显浓度梯度而不断扩散到介质中，当药物与水分子接触后会不断溶解，随着凝胶中释放介质浓度的不断升高，开始向凝胶内部吸水，凝胶由于失水溶胀程度减小，导致药物释放速率下降[47]。崔园园等[48]用海藻酸钠包埋在胰蛋白酶中释放，发现海藻酸钠浓度越高释药率越低。李近[49]研究发现药物载量的提高改变了微球降解过程中孔隙率，从而使药物释放速率降低。

3 结 论

VC释放过程中累计释放分数的变化，遵循本研究所提出的修正模型：X＝Ktne-k’t，且拟合相关系数R2在0.95～0.99之间。动力学常数K（即释放速率），随pH值、温度、以及释放液离子浓度的增加逐渐增大，随载药量的增加而不断减小。WPI凝胶具有环境应答性，以其为载体的活性成分的释放过程受环境pH值、温度、离子浓度、载药量等因素影响，通过调节释放体系的pH值、温度、载药量、释放液离子浓度可以达到控制活性成分释放的目的。本研究结果为WPI作为新型凝胶食品的开发、功能性成分的无损封装和以WPI凝胶为载体的功能性成分的释放体系的开发等现代食品科学技术领域的应用奠定了一定的理论基础。

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Release Kinetics of Ascorbic Acid from Whey Protein Isolate Gel

HE Jinsong, REN Yan, HE Lianjun, LI Juan, DONG Wenming*
(College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)

In this paper, VC was entrapped as a model functional food ingredient into thermally induced whey protein isolate (WPI) gels and then subjected to static release experiments and kinetic analysis in order to investigate the influence of release medium (phosphate buffer) pH and concentration, temperature and drug loading on VC release characteristics and to establish a kinetic model to describe the release process. The results showed that the change in the cumulative release rate of vitamin C from whey protein gels was different from that of sucrose, with the former observed to not follow the Korsmeyer-Peppas model X = Ktninstead follow the modif i ed model presented in this study X = Ktne-k’twith a correlation coeff i cient R2in the range of 0.95-0.99. The release rate of vitamin C increased with the increase in pH value, temperature and buffer concentration, and decreased with the increase in drug loading. Whey protein isolate gels could respond to the environment, and the release process of ascorbic acid was influenced by pH, temperature, drug loading, medium concentration and other factors. Thus the VC release from the carrier could be controlled by adjusting release medium pH and concentration, temperature and drug loading.

whey protein isolate; gel; release characteristics; dynamic model

10.7506/spkx1002-6630-201703003

TS252.1

A

1002-6630（2017）03-0013-07

和劲松, 任艳, 何莲君, 等. 乳清分离蛋白凝胶VC释放过程的动力学[J]. 食品科学, 2017, 38(3)： 13-19 . DOI：10.7506/

spkx1002-6630-201703003. http：//www.spkx.net.cn

HE Jinsong, REN Yan, HE Lianjun, et al. Release kinetics of ascorbic acid from whey protein isolate gel[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 13-19. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703003. http：//www.spkx.net.cn

2016-03-22

国家自然科学基金面上项目（31371875）；云南省教育厅科学研究基金重点项目（2014Z081）作者简介：和劲松（1970—），男，副教授，博士，研究方向为食品蛋白凝胶化理论与功能凝胶开发。E-mail：hejinsong@mail.tsinghua.edu.cn

*通信作者：董文明（1973—），男，教授，硕士，研究方向为食品科学。E-mail：969438516@qq.com