超微量蛋白分析仪在微量树突细胞中ERK蛋白及其磷酸化修饰检测中的应用研究*

任怡然 程雪莲 梁昊岳 白 杨 杨晚竹 于文颖 陈 婷 付伟超 郭 丹*

超微量蛋白分析仪在微量树突细胞中ERK蛋白及其磷酸化修饰检测中的应用研究*

任怡然①程雪莲①梁昊岳①白 杨①杨晚竹①于文颖①陈 婷①付伟超①郭 丹①*

目的：建立利用超微量蛋白分析仪检测微量细胞样品中低丰度细胞外调节蛋白激酶(ERK)及其磷酸化修饰的应用方法，为在科研工作中应用该仪器提供实验依据。方法：采用配制样品溶液，上样、分离、固定、免疫杂交和软件定量等实验步骤，进行化学发光检测，对不同数目树突状细胞中ERK蛋白及其磷酸化修饰的定性及定量结果进行分析。结果：超微量蛋白分析仪能够检测到低至2000个细胞中的目的蛋白并获得定量数据，该仪器还能够有效分辨出20000个细胞中ERK蛋白不同形式的磷酸化修饰。结论：超微量蛋白分析仪有效完成了对低丰度细胞外调节蛋白以及蛋白质翻译后修饰检测。

超微量蛋白分析仪；微量细胞；翻译后修饰；定量；化学发光

[First-author’s address]State Key Laboratory of Experiment Hematology, Institute of Hematology, Hospital of Blood Disease, Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China.

疾病标志物往往是那些生物体内的低丰度蛋白，传统的蛋白分析技术所用的蛋白量通常很大，所得结果的分辨率及重复性很有限。超微量蛋白分析仪是一种新的蛋白质分析系统，使用超微量蛋白分析仪的纳米技术的超微量蛋白免疫分析(nanofluidic proteomic immunoassay，NIA)方法可做到对少量样品、低丰度蛋白以及蛋白质翻译后修饰的定量研究[1-4]。超微量蛋白分析仪所用样本量少，根据等电聚焦原理分离蛋白质，能够灵敏地鉴定出低丰度靶蛋白，并且能够得到大量数据，定量地分析结果[4-6]。对于蛋白质的研究而言，如何更加灵敏、快速、准确地获得相关蛋白质的定量信息，对日后蛋白质研究发展成果向临床医疗转化具有重要的意义。

细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated Protein kinase，ERK)1/2是丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族中一条重要信号通路，能够被多种细胞外刺激激活，调控细胞生长、增殖、分化以及死亡[7-11]。本研究以树突状细胞为样本，研究不同细胞数目的样品中ERK，以及采用脂多糖刺激后ERK蛋白产生磷酸化修饰的定性及定量信息，为微量细胞中低丰度蛋白质及蛋白质翻译后修饰研究提供更加全面的帮助和支持。

1 超微量蛋白分析仪原理

自然界存在的天然蛋白质分子带有电荷，而蛋白质的翻译后修饰，如磷酸化、乙酰化、甲基化等会改变蛋白质的电荷。当蛋白质所处溶液的pH值不等于其等电点时蛋白质带有电荷，并会在电场中移动；当蛋白质处于稳定的pH值梯度中，即pH值等于等电点时蛋白质净电荷为0，在电场中不再移动，因此通过等电点分离，可以有效区分同一蛋白质的不同异构体及不同修饰。基于此原理，超微量蛋白分析仪运行可以分为上样、分离、固定、免疫杂交和定量5个步骤。将样品与两性电解质、荧光pH值指示剂混合，进行毛细管电泳，蛋白质会根据等电点在毛细管里等电聚焦，迁移到固定位置后由紫外光线激活毛细管壁的化学交联作用，将蛋白质捕获，再用高灵敏度一抗、二抗进行免疫杂交，在显色液作用下检测到化学发光信号值，获得定量信息[3，6，12]。

2 超微量蛋白分析仪的应用

2.1 设备与材料

(1)采用Nanopro 1000超微量蛋白分析仪(美国ProteinSimple公司)；384孔板(美国ProteinSimple公司)；细胞裂解液Bicine/CHAPS Lysis Buffer(美国ProteinSimple公司)；荧光指示剂PI Ladder 3(美国ProteinSimple公司)；蛋白酶抑制剂(美国ProteinSimple公司)；两性电解质G3 premix(美国ProteinSimple公司)；抗体稀释液(美国ProteinSimple公司)。

(2)树突状细胞(DC细胞)、一抗anti-ERK1/2抗体(ml)、一抗(抗磷酸)ERK1/2抗体[细胞信号技术(cell signaling technology，CST)]以及二抗(抗磷酸) HRP(细胞生物科学)均来自美国CST公司。

2.2 实验流程

2.2.1 配制上样溶液

不同样品细胞数目分别为500个、1000个、2000个、4000个和8000个，阴性对照不加细胞，阳性对照加入20000个细胞，结合ERK1/2抗体。将脂多糖刺激的细胞分为两组，每组细胞数目为20000个，一组与ERK1/2抗体孵育，一组与抗磷酸ERK1/2抗体孵育。上样溶液配制为下述步骤。

(1)通过流式细胞仪计数，直接将一定数目细胞分选到384孔板内，在384孔板内加入10 μl Bicine/ CHAPS裂解缓冲液裂解，冰上裂解30 min。

(2)将G3 premix与PI Ladder 3按44 μl∶1 μl的比例配成预混液，涡旋振荡15 s；将细胞裂解液与预混液按1∶3混合。同时加入蛋白酶抑制剂，使终浓度为1×磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline，PBS)。

(3)按1∶50将一抗与抗体稀释液混匀，总体积50 μl，按1∶100将二抗与抗体稀释液混匀，总体积50 μl；按1∶1将底物发光液A与B混匀，总体积50 μl。

(4)将含有样品的混合液、一抗稀释液、二抗稀释液以及底物发光液加入384孔板不同排。样品每孔5 μl，其他每孔6 μl。

(5)加样后将384孔板置于4 ℃离心机，2500 r/min离心5 min，须保证孔板里无气泡。离心后将孔板置于冰上等待上机。

2.2.2 上机设置及实验结果分析

(1)打开Compass软件，在Assay界面设置板布局：A排为样品，B排为一抗稀释液，C排为二抗稀释液，F排为底物发光液；设置蛋白质分离时间为40 min；一抗孵育时间为2 h，二抗孵育时间为1 h；设置曝光时间分别为30 s、60 s、120 s、240 s、480 s和960 s；附件设备：清洗瓶装满超纯水，废液瓶倒空；实验试剂盒耗材：放置毛细管盒，仪器清洗液、阳极液和阴极液；将384孔板放入仪器；运行程序。

(2)使用Compass软件分析实验结果。

3 实验结果

3.1 毛细管中蛋白分离情况监测

超微量蛋白分析仪Compass软件可实时监控蛋白质在毛细管中的分离情况。该实验根据ERK等电点，使用两性电解质G3 premix，其分离范围为等电点5～8，荧光指示剂PI Ladder 3会根据等电点分离，在等电点4.9、6.0、6.4、7.0和7.3处有荧光标志(如图1所示)。

图1 毛细管中蛋白分离情况示图

图中每一横排代表一个样品，随着分离时间的增加，荧光标志也会分离在毛细管不同位置以实时监测蛋白质分离情况。实验中ERK蛋白的等电点为5～7，如果能看到荧光指示剂4.9和7.3在视野内则能说明蛋白也在此区间内。选取5个样品为例，由图1中A观察显示，每个样品中5个不同等电点的荧光标志均在视野内显示，表示蛋白质在毛细管中分离情况正常。图1中B显示的是不同时间监测窗口中荧光标志的变化，分别为5 min时和10 min时PI Ladder 3在毛线管中的分离状态。在5 min时荧光指示剂弥漫在整个毛细管中，随着时间的增加，而10 min时荧光指示剂已经慢慢等电聚焦。整个分离时间为40 min，最终荧光指示剂在毛细管中的分布会形成图1A所示。

3.2 不同细胞数目样品结果

(1)当细胞数目样品为8000个细胞时可以看到清晰的蛋白峰，为4000个细胞时仍可以看到蛋白峰，但峰型较小。ERK1和ERK2蛋白质的荧光信号值分别为19.5和105.4，ERK2的S/N＞10，为19.3。2000个细胞时，ERK1和ERK2的荧光信号值分别为5.9和27.7，ERK1和ERK2的S/N＜10，但软件仍可以检测到蛋白峰。1000个细胞组和500个细胞时蛋白峰与背景噪音不可区分，软件不可检出。对照组结果，正对照含有20000个细胞，蛋白峰图清晰且荧光信号值强，ERK1和ERK2蛋白质的荧光信号值分别为1262.8和3845.4，ERK1和ERK2的S/N远＞10，为107.3和436.5。但由于细胞数目多，除了目的蛋白，会出现少量杂蛋白峰。负对照组无细胞，可以看到图中无任何信号。不同细胞数目样品的蛋白峰如图2所示。

图2 不同细胞数目样品中ERK蛋白峰示图

(2)ERK1和ERK2的荧光信号值分别为130.8和470.7且信噪比(S/N)均＞10，分别为23.6和85.9，表明该结果有意义。可以根据蛋白峰面积信息对目的蛋白进行定量研究，不同细胞数目样品的定量信息见表1。

表1 不同细胞数目样品中ERK蛋白定量信息

(3)Nanopro 1000超微量蛋白分析仪相当于更加灵敏和精准的微量western，该系统可以生成模拟western结果的泳道图，如图3所示。

图3 不同细胞数目样品中目的蛋白的模拟western泳道图

图3 显示的是不同细胞数目样品中ERK蛋白的模拟western泳道图，该结果与蛋白峰图显示结果一致，正对照组有明显的ERK1、ERK2蛋白条带以及少量杂蛋白。负对照无条带。在8000个细胞时显示明显的ERK1、ERK2蛋白条带。在4000个细胞时仍可见ERK1、ERK2条带，但是颜色略浅，其他细胞数目样品条带不可见。

3.3 ERK蛋白磷酸化修饰结果

(1)使用总ERK抗体去结合样品时，ERK1、ERK2、pERK1、pERK2、ppERK1以及ppERK2都有清晰的蛋白峰。用ERK蛋白磷酸化抗体结合样品时，峰图中只显示几个有磷酸化修饰的峰。结果表明，nanopro 1000超微量蛋白分析仪能够灵敏的检测出蛋白质翻译后修饰，将有修饰的蛋白与未修饰蛋白清晰的区分开，样品磷酸化修饰的结果如图4所示。

图4 目的蛋白磷酸化修饰峰示图

表2 目的蛋白磷酸化修饰定量信息

(2)ERK蛋白磷酸化修饰定量结果显示，所有峰的S/N均＞10。峰面积信息也可以作为定量研究的依据，见表2。

(3)目的蛋白磷酸化修饰模拟western泳道图结果与蛋白峰图显示结果一致，在总蛋白样品中以及磷酸化修饰样品中可见ERK蛋白及其各种磷酸化修饰的条带，可以进行定性观察，如图5所示。

图5 目的蛋白磷酸化修饰模拟western泳道图

4 讨论

运用Nanopro 1000超微量蛋白分析仪对不同数目的细胞样品以及目的蛋白翻译后修饰进行研究，证明该仪器能够对低丰度蛋白定性及定量，并且适用于蛋白质翻译后修饰研究。该仪器对信号通路的研究提供了新的视角[13-14]。随着蛋白质研究的不断深入，Nanopro 1000超微量蛋白分析仪也应用于临床研究。有文献报道，使用Nanopro 1000超微量蛋白分析仪研究20例早期结直肠癌患者术后缺血组织样本中与癌症相关生物标志物磷酸化修饰的定量结果，发现与正常组织相比，ERK1/2非磷酸化增多、AKT磷酸化增多、MEK1/2磷酸化增多[5]。Tikhanovich等[15]报道，使用Nanopro 1000超微量蛋白分析仪对foxo3蛋白不同形式的翻译后修饰进行定量，研究丙型肝炎病毒和酒精共同作用诱导产生的foxo3翻译后修饰这一复杂模型是如何导致丙肝发病，有效地为临床检测提供科学依据。

5 结语

随着超微量蛋白分析技术的发展，该技术在科学研究领域的应用更加广阔，可成为临床检测的重要手段。

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Application study of Nanopro 1000 in the detection of ERK protein in trace dendritic cells and its phosphorylation product/

REN Yi-ran, CHENG Xue-lian, LIANG Hao-yue, et al//China Medical Equipment,2017,14(2):131-134.

Objective:To understand the principles of Ultramicro-protein analyzer system and provide a reference for using it by analyzing low abundance ERK in trace dendritic cell and its phosphorylation product. And to provide application experience of this equipment in science and research work.Methods:The qualitative and quantitative results of ERK and its phosphorylation product in different numbers of dendritic cells were analyzed by means of preparation of sample, such as solution, instrument operation and software analysis.Result:Ultramicro protein analyzer system can detect target protein in as low as 2000 cells and obtain quantitative data. The instrument also can efficiently distinguish different phosphorylation modification form of ERK in 20000 cells.Conclusion:This system is very helpful for the study of low abundance extracellular regulation protein and post-translational modification of proteins.

Nanopro 1000 system; Trace cell; Post-translational modification; Quantification; Chemiluminescence

1672-8270(2017)02-0131-04

R197.39

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.02.039

2016-11-04

天津市应用基础与前沿技术研究计划(青年项目)(15JCQNJC10300)“G-CSF动员造血干祖细胞的分子机制研究”

①中国医学科学院血液病医院血液学研究所 实验血液学国家重点实验室 天津 300020

*通讯作者：guodan@ihcams.ac.cn

任怡然,女,(1990- ),硕士研究生。技师。中国医学科学院血液病医院血液学研究所 实验血液学国家重点实验室，研究方向：基因与蛋白相关仪器的应用。