当归颗粒剂与煎剂有效成分及体外抑菌活性比较

孙 鹏，张 鑫，贺 凯，潘 琼，王 爽，李金荣，郭亚男，曹思婷，白晓南，何生虎*

(1.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021；2.宁夏回族自治区药品检验所，宁夏银川 750001;3.银川第二人民医院药剂科，宁夏银川 750001)

当归颗粒剂与煎剂有效成分及体外抑菌活性比较

孙 鹏1△，张 鑫1△，贺 凯2，潘 琼3，王 爽1，李金荣1，郭亚男1，曹思婷1，白晓南1，何生虎1*

(1.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021；2.宁夏回族自治区药品检验所，宁夏银川 750001;3.银川第二人民医院药剂科，宁夏银川 750001)

为了比较当归颗粒剂与煎剂在有效成分和药效上的差异，采用薄层色谱法(TLC)鉴定当归颗粒剂；高效液相色谱法(HPLC)测定颗粒剂、煎剂和对照药材中阿魏酸的含量；应用《中药色谱指纹图谱相似度评价》软件对颗粒剂、煎剂进行相似度评价，同时进行体外抑菌试验。结果表明，当归颗粒剂TLC图中存在当归对照药材的特征斑点，与对照药材HPLC特征图谱相似度达95.1%；颗粒剂、煎剂和对照药材中阿魏酸的含量分别为3.95、1.69、2.84 mg/g；抑菌结果为金黄色葡萄球菌、沙门菌抑菌圈颗粒剂和煎剂相同，大肠埃希菌、链球菌抑菌圈颗粒剂>煎剂。通过试验发现，当归颗粒剂中有效成分与对照药材相近，体外抑菌结果优于煎剂。

当归颗粒剂；煎剂；薄层色谱法；高效液相色谱法；指纹图谱；体外抑菌

当归性温，味辛、甘，入心、肝、脾、肺经。功效养血、活血止痛[1]。本品味甘而重，故专能补血，适用于血虚引起的各种证候，常用于跌打损伤瘀痛，风湿痹痛及经络不利等证，具有良好的活血止痛作用[2]。 临床上当归颗粒剂替代当归药材使用，可以提高药材的利用率，减少浪费，并且计量准确[3]。中医临床已被广泛使用，但在兽医临床上鲜有报道和应用，本研究旨在为当归颗粒剂替代水煎剂，应用于兽医临床治疗提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物 当归对照药材(批号：120927-201315，1 g)、阿魏酸对照品(批号：110773-201012，20 mg)，中国食品药品检定研究院；当归颗粒剂(批号：5111802，3 g包装相当于饮片10 g)，广东一方制药有限公司；当归饮片(批号：150601)，毫州金勺堂中药饮片有限公司。

1.1.2 主要试剂 甲醇、乙腈(色谱纯)，德国默克公司产品；甲酸、无水乙醇、乙醚、环己烷、二氯甲烷、碳酸氢钠、稀盐酸均为分析纯；超纯水，实验室自制。

1.1.3 菌种与培养基 菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌和链球菌，均由宁夏大学农学院兽医微生物实验室分离、鉴定并保存；MH琼脂(批号：20140814)，青岛高科园海博生物技术有限公司产品。

1.1.4 仪器、耗材与软件 1200高效液相色谱仪，美国Agilent公司产品；KQ-300VDB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；BS210型电子天平，深圳市深美仪器有限公司产品；薄层色谱展开缸，硅胶G薄层板(100 mm×200 mm，批号：710808)，青岛海洋化工特种硅胶有限公司产品；中药色谱指纹图谱相似度评价系统2008版，中国软件与技术服务股份有限公司研发。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

1.2.1.1 煎剂 将当归饮片粉碎至40目，放入药材重量10倍量的水中煎煮3次，每次1 h，然后将所有提取溶液混合，单层滤纸过滤后置于旋转蒸发仪上浓缩制成1∶1的流浸膏，即1 g药材最后得到1 mL流浸膏。

1.2.1.2 颗粒剂 取当归颗粒剂1包(3 g包装)，溶于10 mL超纯水中，即得相对于当归饮片浓度1 g/mL的溶液。

1.2.2 TLC法

1.2.2.1 供试品溶液的制备 取颗粒剂样品3 mL，加10 g/L碳酸氢钠溶液50 mL，超声处理10 min，离心，取上清液用稀盐酸调节pH至2～3，用乙醚振摇提取2次，每次20 mL，合并乙醚液。待乙醚液挥发干，残渣加1 mL甲醇使溶解，作为供试品溶液。

1.2.2.2 对照品溶液的制备 取当归对照药材3 g，同“1.2.2.1”法制成对照药材溶液。取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。

1.2.2.3 薄层层析 照薄层色谱法[4]，吸取同“1.2.2.1”法制备的当归颗粒剂、同“1.2.2.2”法制备的对照药材和对照品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙醇-甲酸(4∶1∶1∶0.1)为展开剂展开，取出晾干后，置365 nm紫外光灯下检视。

1.2.3 HPLC法

1.2.3.1 色谱条件 照高效液相色谱法[4]，色谱柱：AgilentExtend-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温：35℃，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.85 mL/L磷酸溶液为流动相B，流速：1.0 mL/min，检测波长：316 nm，进样量：10 μL，洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.2.3.2 供试品溶液的制备 取当归颗粒剂、煎剂样品0.2 mL，置锥形瓶中，加人700 mL/L甲醇20 mL，密塞后称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用700 mL/L甲醇补足减失的重量。摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

1.2.3.3 对照药材溶液的制备 取当归对照药材0.2 g，同“1.2.3.2”法制成对照药材溶液。

1.2.3.4 对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品，加700 mL/L甲醇制成每1 mL含12 μg的溶液，作为对照品溶液。

1.2.3.5 方法学考察

(1)标准曲线的制备 精密量取适量的阿魏酸标准品溶液置于容量瓶中，用甲醇配成系列标准溶液，使浓度分别为0.001、0.010、0.020、0.050、0.100、1.000 mg/mL，按“1.2.3.1”项色谱条件分别进样10 μL测定。

(2)稳定性考察 在避光条件下，精密吸取当归颗粒剂、煎剂各5份，进样量10 μL，分别于0、2、4、8、12、24 h进样。

(3)精密度考察 精密吸取阿魏酸对照品溶液10 μL，按“1.2.3.1” 项色谱条件，连续进样6次，测峰面积。

(4)重复性考察 精密吸取当归颗粒剂、煎剂，同“1.2.3.2”法平行制备6份供试品溶液，按“1.2.3.1” 项色谱条件分别进样分析。

1.2.3.6 HPLC特征图谱 同“1.2.3.2、1.2.3.3”法制备当归颗粒剂、煎剂和对照药材溶液，按“1.2.3.1”项色谱条件测定特征图谱。

1.2.3.7 阿魏酸含量测定 同“1.2.3.2、1.2.3.3”法制备当归颗粒剂、煎剂和对照药材各3份，按“1.2.3.1”项色谱条件测定。

1.2.3.8 指纹图谱相似度匹配 打开《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2008版》软件，导入当归颗粒剂、煎剂和对照药材溶液HPLC特征图谱，将对照药材溶液HPLC特征图谱设定为参照图谱后，与当归颗粒剂、煎剂HPLC特征图谱进行自动匹配，利用相似度计算功能对颗粒剂和煎剂进行相似度评价。

1.2.4 体外抑菌试验

1.2.4.1 菌液制备 将菌种接种于营养肉汤中，37℃培养24 h后，采用平板倾注法进行活菌计数并将菌液浓度稀释为105CFU/mL的含菌量。

1.2.4.2 MH琼脂培养基制备 将培养基装在三角瓶中，121℃高压灭菌15 min。无菌条件下，温度控制在45℃时倒入平皿中。链球菌使用加50 mL/L绵羊血的MH琼脂。

1.2.4.3 当归颗粒剂及煎剂体外抑菌试验 取稀释好的菌液100 μL，均匀涂在MH琼脂板上，在室温下干燥3 min～5 min。采用牛津杯法，进行抑菌试验[5]。将培养基平均分为5个区域，用无菌镊子将无菌牛津杯放在固定位置，用手轻轻加压，使不产生空隙。最后在牛津杯中加入100 μL(1 g/mL)药液，将培养皿小心移入培养箱中，37℃培养18 h～24 h，测量抑菌环直径。设3个平行试验组，并设阳性、空白对照。

1.2.4.4 结果判定 抑菌效果判定标准：参考文献标准[6]，抑菌直径(d)≥20 mm为极敏，20 mm>d≥15 mm高敏；15 mm>d≥10 mm为中敏，10 mm>d>8 mm为低敏，d≤8 mm无抑菌效果。

2 结果

2.1 TLC法

在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，见图1。

2.2 HPLC法

2.2.1 方法学考察

2.2.1.1 标准曲线 以标准品溶液的质量浓度(x)为横坐标，峰面积积分值(y)为纵坐标，绘制阿魏酸的标准曲线，回归方程为y=1.031×104+9.380×107x(r=0.999 6，n=6)。结果表明，阿魏酸的质量浓度在0.001 mg/mL～1.000 mg/mL范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系(保留时间17.73 min)。

2.2.1.2 稳定性考察 阿魏酸的峰面积RSD(n=6)均<1.47%，表明供试品溶液中阿魏酸在24 h内稳定。

2.2.1.3 精密度考察 阿魏酸的峰面积RSD(n=6)为0.57%，表明本方法精密度良好。

2.2.1.4 重复性考察 阿魏酸的峰面积RSD(n=6)均<2.24%，说明本方法重复性良好。

1.当归颗粒剂; 2.当归对照药材; 3.阿魏酸

1.Angelicagranules; 2.Angelicasinensisradix; 3.Ferulic acid

图1 当归TLC图谱
Fig.1 TLC ofAngelicasinensis

2.2.2 HPLC特征图谱 结果见图2和图3。

2.2.3 阿魏酸含量计算结果 由表2可知,当归颗粒剂、煎剂和对照药材中含阿魏酸的量分别为3.95、1.69、2.84 mg/g。

2.2.4 相似度比较 当归颗粒剂与当归对照药材指纹图谱相似度较高，达到95.1%，当归煎剂与当归对照药材指纹图谱相似度为93.9%。

2.2.5 体外抑菌结果 观察抑菌圈大小并记录结果，见表3。由表3可知，金黄色葡萄球菌、沙门菌抑菌圈颗粒剂和煎剂相同，大肠埃希菌、链球菌抑菌圈颗粒剂>煎剂。

3 讨论

本试验样品的处理方法均参照2015年版《中国药典》(一部)方法，该方法简便快捷。测定阿魏酸含量的方法在24 h内稳定可靠；精密度重复性好，且颗粒剂与对照药材HPLC特征图谱相似度达95.1%，该方法可以用于当归颗粒剂的质量评价。

当归颗粒剂、煎剂和对照药材中阿魏酸的含量分别为3.95、1.69、2.84 mg/g，颗粒剂中阿魏酸含量最高，这一结果与张惠等[7]报道中药颗粒剂和传统饮片的化学成分在种类、含量无明显差异，有的甚至比饮片煎剂含量更高的结论一致。

S1.当归颗粒剂; S2.当归煎剂; S3.当归对照药材

图3 阿魏酸对照品HPLC总离子流图

表2 阿魏酸含量

表3 当归颗粒剂和煎剂体外抑菌结果

中药指纹图谱相似度是辨别中药材真伪和质量优劣的一项重要指标[8]。它是以谱峰面积值作为比对计算参数，利用色谱工作站可获取谱图中各指纹峰的保留时间和峰面积数据进行相似度评价，能够全面、客观地反映中药指纹图谱间的相似程度，进而评价中药材质量[9]。

由于MH琼脂培养基产品批间药物敏感试验重复性比其他培养基好，接种于MH琼脂培养基上，绝大多数致病菌生长良好，故体外抑菌试验采用MH培养基[10]。本试验中当归颗粒剂抑菌作用优于水煎剂，这一结果与任非等[11]报道的颗粒剂的抑菌作用弱于煎剂不一致，可能与其实验室检测所使用的免煎剂有关。当归煎剂对大肠埃希菌、链球菌无抑菌效果，可能与原药材质量和制备工艺有关，提取时间、次数和加水量等因素均会影响有效成分的溶出。

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Comparison of Active Compositions and Antibacterial ActivitiesinVitrobetweenAngelicaGranule and Decoction

SUN Peng1,ZHANG Xin1,HE Kai2,PAN Qiong3,WANG Shuang1,LI Jin-rong1, GUO Ya-nan1,CAO Si-ting1,BAI Xiao-nan1,HE Sheng-hu1

(1.SchoolofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia,750021,China; 2.NingxiaDrugInspectionAgency,Yinchuan,Ningxia,750001,China;3.PharmacyDepartment,YinchuanNo.2People'sHospital,Yinchuan,Ningxia,750001,China)

To compare differences in active compositions and efficacy betweenAngelicagranules and decoction，theAngelicagranules were identified by thin layer chromatography (TLC),the contents of ferulic acid inAngelicagranules, decoction andAngelicasinensisradix were detected by high performance liquid chromatography (HPLC), the similarities of the three solutions were evaluated by "chromatographic fingerprint similarity evaluation" software. In addition, the antibacterial tests were made.Angelicagranule was characterized in theAngelicasinensisradix by TLC figure. HPLC characteristic spectrum similarity was higher than 95.1%. The amount of ferulic acid was 3.95 mg/g, 1.69 mg/g and 2.84 mg/g in granules, decoction andAngelicasinensisradix respectively. The antibacterial results of granules and decoction showed that there is the same inhibition zone toStaphylococcusaureusandSalmonellasp.,toEscherichiacoliandStreptococcussp. inhibition zone: granules > decoction. The results found thatAngelicagranules contain active compositions which were similar toAngelicasinensisradix, and showed more effective inhibition results than decoction.

Angelicagranule; decoction; TLC; HPLC; fingerprint; antibacteriainvitro

2016-06-28

孙 鹏(1986-)，男，山东泰安人，博士研究生，主要从事动物疫病防控技术研究。△同等贡献作者*通讯作者

S853.75

A

1007-5038(2017)02-0050-05