肾脏组织工程研究进展

陈玉琴，杨亦彬

(遵义医学院附属医院肾内科，贵州遵义563003)

·综述·

肾脏组织工程研究进展

陈玉琴，杨亦彬

(遵义医学院附属医院肾内科，贵州遵义563003)

慢性肾脏病(CKD)已成为日益严重的公共卫生问题，其持续进展的共同结局是终末期肾脏病(ESRD)。透析和肾移植是目前ESRD主要替代治疗手段，但存在种种不足或受限。新兴的组织工程技术在修复、改善和重建人体病损组织或器官已取得可喜的进展，其相关技术手段也为肾脏组织工程的研究提供了可能。

肾脏；组织工程；种子细胞；支架；3D生物打印

组织工程旨在应用细胞生物学、生物材料和工程学的原理，研发用于修复、改善和重建人体病损组织或器官的生物活性替代物。细胞来源、支架材料以及生物活性物质是组织工程策略3个主要的组件[1]。肾脏是机体主要的排泄器官，通过肾小球滤过、肾小管上皮细胞和周围的微血管以及间质支持系统互补，来调节清除废物和重吸收。而如何选择合适的支架材料来模拟体内正常的生长环境，对诱导种子细胞形成肾脏组织是至关重要的。近年来，新兴技术如去细胞和生物打印技术革新了组织工程领域，是目前最有前景的两个器官生物工程方法，使创造复杂的三维器官(如肾脏)成为可能[2-3]。

1 种子细胞的研究

种子细胞是组织工程的核心内容之一，能为支架材料提供生命源泉，其主要来源于自体、同种异体或异种，具有增殖和分化为特定细胞的能力以及不引起免疫排斥反应等特点。胚胎干细胞(ESCs)来源于胚胎囊胚的内细胞团[4]，是最早期的未分化细胞，具有无限增殖、自我更新和多向分化的潜能，但涉及伦理及移植排斥反应是临床应用最主要的障碍。而由多个转录因子重编程普通体细胞获得人类诱导多能干细胞(IPSCs)，绕开了ESCs面临的技术难题和伦理障碍，在再生医学及疾病模型等研究领域有着广阔的应用前景。肾脏是由中胚层通过输尿管芽的形成和毗邻的中胚层派生的后肾间质分化形成[5]。IPSCs可定向分化成肾脏足细胞，并诱导后肾间质标记物的表达，如Wilms肿瘤基因(Wilms tumor 1，WT1)、Pax2基因(paired box gene 2，Pax2)，WT1和Pax2为肾小管上皮细胞胚胎分化、发育的关键基因[6]。Kim等[7]应用视黄酸、激活素-A和骨形态发生蛋白质7与ESCs共培养，其ESCs最终可表达中胚层标记，进一步培养后形成肾小管上皮样结构。在体外，这种干细胞来源的组件显示肾再生的可能性。

间充质干细胞(MSC)由于免疫原性小，不易被宿主免疫系统识别，异体甚至异种移植都具有较好的治疗效果，被认为是很有潜力、值得深入研究的组织工程种子细胞。MSC用于肾脏疾病的治疗才刚刚起步，众多研究表明MSC可能成为难治性肾脏疾病的最佳种子细胞。Kale等[8]认为肾组织损伤后，骨髓间充质干细胞具有能向肾脏内迁移，并定植于肾脏的特性。许多肾脏病理学模型研究也发现MSC可以归巢到受损的肾脏，促进组织修复。

除干细胞外，在组织工程模型的发展中，自体或异体的肾细胞是最直接的来源，迄今已建立了许多动物的肾细胞系，包括狗、猪、兔和老鼠。最近，人近曲小管上皮细胞系HK-2细胞通过不同的细胞永生化技术得到了发展并大量应用于组织工程[9]。

2 支架的研究

生物材料在组织工程中起着替代细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的作用，且必须满足几个关键特征：(1)生物相容性；(2)拥有适当的机械强度；(3)显示生物活性来调节3D细胞微环境；(4)具有足够的间隙供营养和代谢废物扩散。ECM是由细胞分泌到胞外的大分子物质，构成复杂的网架结构，因其独特的优点而成为应用最广的支架材料。ECM支架呈三维空间结构，提供天然和高度保守的基质供细胞生存和增殖，还可通过调控信号转导通路影响细胞分化和迁移。同时，ECM支架能促进移植物新生血管生成，其降解过程中可释放血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、转化生长因子(transforming growth factorβ，TGFβ)等，在支架降解后继续促进新生组织分化和生长[10]。

2.1 丝支架慢性肾脏疾病发生发展是渐进的，某些遗传性肾病(如多囊肾病)其肾脏病变出现时间跨度较长，故持续监测病理生理变化，对阐明疾病进展和防治是非常必要的。较长时间体外培养的组织结构，其可持续性是组织工程领域长期存在的问题。传统的实验方法包括动物模型和细胞二维培养，存有一定的局限性，而种子细胞在三维条件下培养更接近体内真实情况[11]。静态系统三维结构培养的细胞3周后开始崩溃，细胞存活率随时间的推移而降低[12]，故选择良好的生物材料作支架，对维持长期的组织培养是必不可少的。丝素蛋白(silk fibroin，SF)主要是从家蚕中提取[13]，作为支架具有以下特性：良好的生物相容性，缓慢的生物降解，有强大的力学性能，可保持长时间的框架和开放的多孔结构，而且不需要化学交联。同时，丝素也可以制备成水凝胶、复合材料、纤维、微球和薄膜等。丝素需数月至数年才会降解而不会有过早的结构坍塌以及在缓慢重塑中支持细胞间的相互作用。Subramanian等[12]通过基于丝素的多孔支架、基质胶原和灌注反应堆系统生成3D肾组织模型，成功模拟了肾小管功能，且在灌注条件下至少存活6周。这些多孔的丝支架可能有利于模拟需要较长时间研究的慢性肾脏疾病模型。

2.2 水凝胶水凝胶是一类具有化学或物理交联结构、可吸收并保持大量水分而不溶于水的三维支架材料。水凝胶质地柔软，富有弹性，与活体软组织质感相近。此外，水凝胶的三维空间网络结构和天然ECM相似，可通过调节孔隙率、孔径大小、增大内表面积等途径，促进细胞粘附、植入与增殖。天然和合成聚合物通过各种化学交联的共价键、物理交联的非共价相互作用或通过两者的组合交联形成水凝胶矩阵，可增强水的吸附作用，能保持一定的形状，利于细胞增殖所需的氧气和营养物质的传递和运输[14]。生物聚合物水凝胶由于其被改型而仍能呈递与体内相似的细胞信号而作为肾脏组织工程的首选[9]。Manivannan等[15]通过使用聚二甲硅氧烷模具构建胶原蛋白渠道，种子细胞嵌入在这些凝胶系统并且随机间隔与其一致的结构形式，这个系统实现了控制小管形成并且允许示踪细胞的迁移。

2.3 器官脱细胞器官脱细胞后形成的生物支架已成功应用于组织工程和再生医学[16]，而脱细胞肾脏是一个相对较新的技术。脱细胞的过程通常会产生一个具有ECM分子的三维生物支架[17]，ECM可以影响细胞粘附、增殖、分化、形态发生和表型表达等一系列生物学过程，这些因素都有利于肾脏再生。肾脏脱细胞支架可以由啮齿动物、猪、恒河猴以及人类的肾脏产生[18]，脱细胞后，肾支架已被证实能保存肾小球、肾小管结构以及血管网络[19]。利用脱细胞的肾组织工程支架，多能人胚胎干细胞(hESC)被播种在整个或局部肾脏ECM，通过差异化分析hESC表型来了解细胞迁移，发现肾谱系标记随着时间的推移逐步调节hESC基因表达。恒河猴脱细胞肾可提供天然的ECM且有足够的空间和组织影响hESC的迁移和分化[20]。然而，获得一个合适的人类供体肾存有一定困难，寻找理想的替代异种肾仍是一个挑战。有研究证明大鼠、猪、猴子的肾是有潜力的，却具有极强的免疫原性以及各种人畜共患病的风险。羊肾人畜共患病风险低，且器官结构和大小类似于人类，可能是相对理想的器官来源。Vishwakarma等[21]开发了3D山羊肾支架，通过脱细胞洗涤剂灌注，抗凝剂预处理后，发现脱细胞羊肾支架具有完整的3D自然架构和脉管系统，这为肾脏再生提供较好模型。

选择最佳来源种子细胞在脱细胞肾支架中增殖是一个仍未解决的问题。目前认为，由多能性干细胞(PSC)来源的肾祖细胞比其他更成熟的细胞用于生物工程肾更合适。原位移植肾支架在技术上是可行的，为了更好地执行移植肾支架的功能，还需要进一步研究这些PSC来源细胞的类型及分化和成熟过程。此外，血栓形成也是肾支架植入的一个主要障碍。有研究报道将脱细胞猪肾支架植入受体猪两周以后，发现广泛的血栓形成，因此为了维持植入脱细胞肾支架的时间，其支架的血管供给是必须考虑的问题[22]。

目前，脱细胞基质的研究涉及各种器官和组织。新近有学者将肾脏脱细胞基质制成凝胶，发现脱细胞基质经处理后可形成白色半透明的凝胶，呈网状、多孔结构，适合细胞长入，并利用肾小管上皮细胞初步验证了其生物相容性[23]。这为肾脏组织工程支架的选择提供了新的思路。

3 生物反应器

生物反应器提供的动态培养可使支架内的氧及营养传播更充分[24]，代谢产物更容易排出，以及使种子细胞超过被动扩散的深度。此外，生物反应器还能提供很多培养组织所必需的物理信号。

在体外构建肾脏模型除了细胞和支架的选择外，更重要的是如何能更好的模拟体内的环境?其中体内流体流动的模拟是至关重要的。液体过滤是肾脏的重要功能，主要依赖肾小球和肾小管区流体流动所形成的剪切应力，其中以灌注为基础的流体流动更适合在体外模拟体内肾功能，并通过使用生物反应器系统完成，微流体系统便是其中很好的例子。通过多层微流控装置来培养及分析肾小管上皮细胞，在最佳的流体条件下，通过增强细胞极化，验证了细胞骨架的重组[25]。此外，对流体流动的控制可能会得到不同的生物工程模型，从而能更好的模拟不同的疾病状态。

4 3D生物打印

面临国际上器官日益短缺的现状，3D生物打印[26]可能是解决这一难题最有潜力的新兴技术。3D生物打印制作技术用于精确分配细胞负载(cell-laden)生物材料来制造复杂的功能性3D活组织或器官[27]。目前研究仍处于初级阶段，涉及到的主要技术挑战包括高分辨率细胞沉积、细胞分布控制以及三维组织的血管化、神经支配等。3D生物打印主要包括3大方式：喷墨、激光辅助和挤压生物打印，3种技术各有特定的优势、弱点和局限性，但都是基于单层的印刷法，通常很难印刷复杂的空心结构，因此，每一层都必须互相连接和机械支持打印[3]。目前，结合人类多能干细胞技术的最新进展，3D生物打印主要涉及到细胞、肌肉、骨和软骨。微脉管系统打印的成功应用预示着在生产功能齐全的血管和神经支配的复杂组织方面(如肾脏、肝脏等)，3D生物打印有可能是唯一的解决方案[28]。

5 展望

为了更好的概括肾脏的结构和功能，模拟不同的疾病状态，关键在于组织工程化肾脏如何维持种子细胞的生长；维护表型和功能的稳定以及单个组件的开发并结合为一个整体系统，这些都是肾脏组织工程可控、可靠及可持续发展的必要条件。未来的研究需要发展更强大的混合动力系统使三维组织结构和复杂的细胞相互作用以及与流体流动更好的结合[9]。脱细胞和3D生物打印技术在肾脏方面的应用虽然尚处于初级阶段，但具有广阔的应用前景。相信随着有关学科的发展,组织工程方法替代肾脏功能的研究必将会给肾脏病患者带来新的希望，有望突破器官移植的范畴，步入器官制造的新时代。

[1]Tevlin R,Walmsley GG,Marecic O,et al.Stem and progenitor cells:advancing bone tissue engineering[J].Drug Deliv Transl Res,2016,6(2):159-173.

[2]Katari R,Peloso A,Zambon JP,et al.Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys[J].Nephron Exp Nephrol,2014,126(2):119.

[3]Mandrycky C,Wang Z,Kim K,et al.3D bioprinting for engineering complex tissues[J].BiotechnolAdv,2016,34(4):422-434.

[4]Kingham E,Oreffo RO.Embryonic and induced pluripotent stem cells:unders-tanding,creating,and exploiting the nano-niche for regenerative medicine[J].ACS Nano,2013,26,7(3):1867-1881.

[5]Takasato M,Er PX,Becroft M,et al.Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney[J].Nat Cell Biol,2014,16(1):118-126.

[6]Song B,Smink AM,Jones CV,et al.The directed differentiation of human iPS cells into kidney podocytes[J].PLoS One,2012,7(9):e46453.

[7]Kim D,Dressler GR.Nephrogenic facors promote differentiation 0f mouse embryonic stem cells into renal epithelia[J].J Am Soc Nephrol,2005,16(12):3527-3534.

[8]Kale S,Karihaloo A,Clark PR,et a1.Bone marrow stem cells contribute to repair of the ischemically injured renal tubule[J].J Clin Invest,2003,112(1):42-49.

[9]Desrochers TM,Palma E,Kaplan DL,et al.Tissue-engineered kidney disease models[J].Adv Drug Deliv Rev,2014,69-70:67-80.

[10]Brown BN,Badylak SF.Extracellular matrix as an inductive scaffold for funct-ional tissue reconstruction[J].Transl Res,2014,163(4):268-285.

[11]Desrochers TM,Suter L,Roth A,et al.Bioengineered 3d human kidney tissue,a platform for the determination of nephrotoxicity[J].PLoS One,2013,8(3):e59219.

[12]Subramanian B,Rudym D,Cannizzaro C,et al.Tissue-engineered three-Dimensionalin vitromodels for normal and diseased kidney[J].Tissue EngPartA,2010,16(9):2821-2831.

[13]Melke J,Midha S,Ghosh S,et al.Silk fibroin as biomaterial for bone tissue engineering[J].Acta Biomater,2016,31:1-16.

[14]Buwalda SJ,Boere KW,Dijkstra PJ,et al.Hydrogels in a historical perspective:from simple networks to smart materials[J].J Control Release,2014,190:254-273.

[15]Manivannan S,Gleghorn JP,Nelson CM.Engineered tissues to quantify collective cell migration during morphogenesis[J].Methods Mol Biol,2012,886:173-182.

[16]Jin M,Yaling Y,Zhibin W,et al.Decellularization of rat kidneys to produce extracellular matrix scaffolds[J].Methods Mol Biol,2016,1397:53-63.

[17]Batchelder CA,Martinez ML,Tarantal AF.Natural scaffolds for renal d-ifferentiation of human embryonic stem cells for kidney tissue engineering[J].PLoS One,2015,10(12):e0143849.

[18]Katari R,Peloso A,Zambon JP,et al.Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys[J].Nephron Exp Nephrol,2014,126(2):119.

[19]Montserrat N,Garreta E,Izpisua Belmonte JC.Regenerative strategies for kidney engineering[J].FEBS J,2016,283(18):3303-3324.

[20]Nakayama KH,Lee CC,Batchelder CA.Tissue specificity of decellularized rhesus monkey kidney and lung scaffolds[J].PLoS One,2013,8(5):e64134.

[21]Vishwakarma SK,Bhavani PG,Bardia A,et al.Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ[J].Indian J Nephrol,2014,24(6):372-375.

[22]Peloso A,Ferrario J,Maiga B,et al.Creation and implantation of acellular rat renal ECM-based scaffolds[J].Organogenesis,2015,11(2):58-74.

[23]张炜炜,刘瑾,陈伟.犬肾脏脱细胞基质凝胶的制备及生物相容性实验研究[J].第三军医大学学报,2015,37(19):1942-1945.

[24]Simmons AD,Williams C 3rd,Degoix A,et al.Sensing metabolites for the monitoring of tissue engineered construct cellularity in perfusion bioreactors[J].Biosens Bioelectron,2017,90:443-449.

[25]Rosines E,Johkura K,Zhang X.Constructing kidney-like tissues from cells based on programs for organ development:toward a method ofin vitrotissue engineering of the kidney[J].Tissue Eng Part A,2010,16(8):2441-2455.

[26]Reed S,Lau G,Delattre B,et al.Macro-and micro-designed chitosan-alginate scaffold architecture by three-dimensional printing and directional freezing[J].Biofabrication,2016,8(1):015003.

[27]Pati F,Jang J,Ha DH,et al.Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink[J].Nat Commun,2014,5:3935.

[28]Gao G,Cui X.Three-dimensional bioprinting in tissue engineering and regenerative medicine[J].Biotechnol Lett,2016,38(2):203-211.

R692

A

1003—6350（2017）18—3013—03

2017-02-15)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.18.026

国家自然科学基金（编号：81260118）

杨亦彬。E-mail:yyb1011@sina.com