饲粮能氮水平对不同品种猪肉质性状及相关基因表达的影响

刘莹莹李凤娜李颖慧印遇龙孔祥峰∗

（1.中国科学院亚热带农业生态研究所，亚热带农业生态过程重点实验室，湖南省畜禽健康养殖工程技术研究中心，农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站，长沙 410125；2.湖南省畜牧兽医研究所，长沙 410131；3.中国科学院大学，北京 100049；4.湖南畜禽安全生产协同创新中心，长沙 410128）

饲粮能氮水平对不同品种猪肉质性状及相关基因表达的影响

刘莹莹1，2，3李凤娜1，4李颖慧1，3印遇龙1孔祥峰1∗

（1.中国科学院亚热带农业生态研究所，亚热带农业生态过程重点实验室，湖南省畜禽健康养殖工程技术研究中心，农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站，长沙 410125；2.湖南省畜牧兽医研究所，长沙 410131；3.中国科学院大学，北京 100049；4.湖南畜禽安全生产协同创新中心，长沙 410128）

本试验旨在研究饲粮能氮水平对不同品种猪肉质性状以及肌纤维类型和细胞因子相关基因表达的影响。选取巴马香猪和长白猪共96头（48头/品种），随机分为4组（每组24头猪），分别为长白猪饲喂NRC饲粮组、长白猪饲喂我国地方猪标准（GB）饲粮组、巴马香猪饲喂NRC饲粮组、巴马香猪饲喂GB饲粮组。试验从5周龄开始，至出栏时结束。分别于保育期、生长期和肥育期末，每组选择8头体况相近猪只屠宰，采集肌肉样品分析。结果表明：生长阶段显著影响了试验猪背最长肌熟肉率和肌球蛋白重链（MyHC）Ⅱx、MyHCⅡb及白细胞介素-15（IL-15）mRNA表达水平（P＜0.05），且随生长阶段呈增加趋势；与长白猪相比，巴马香猪的背最长肌熟肉率、MyHCⅠmRNA表达水平显著升高（P＜0.05），而滴水损失显著降低（P＜0.05）；与NRC饲粮相比，GB饲粮显著提高了生长期长白猪和巴马香猪的pH45min（P＜0.05），显著上调了保育期和肥育期猪背最长肌MyHCⅠmRNA表达水平（P＜0.05）；与GB饲粮相比，NRC饲粮显著上调了生长期猪背最长肌MyHCⅠ mRNA表达水平（P＜0.05）。由此可见，品种和生长阶段均可显著影响肉质性状及相关基因的表达，饲粮能氮水平则主要通过与生长阶段产生互作效应影响肉质性状及肌纤维类型相关基因的表达。

肉质性状；肌纤维类型；细胞因子；巴马香猪；饲粮能氮水平

猪肉是猪以自身生物学特性和遗传为基础，以机体的正常营养代谢为平台，通过摄入饲粮养分，在生长发育过程中协调营养素向肌肉组织的沉积而形成的。肌纤维作为构成肌肉的基本单位，不仅决定骨骼肌的生长发育，还影响猪肉的生理生化特性、宰后代谢活动及感官品质。肌肉中肌纤维肥大、肌纤维类型的组成与转化以及肌内脂肪沉积均是影响优良肉质性状形成的主要因素［1］。调节肌纤维类型及其转化是改善肉质的重要途径［2］。肌肉由不同类型的肌纤维组成，根据其所含的酶系及其活性和收缩功能，可将肌纤维分为慢速氧化型（Ⅰ型）、快速氧化型（Ⅱa型）、快速酵解型（Ⅱb型）和中间型（Ⅱx型）［3］。 Ⅰ型肌纤维细小，脂质、肌红蛋白含量较高，因此肌肉中Ⅰ型肌纤维比例较高，则其肉色、嫩度和风味等较好；而Ⅱb型肌纤维粗大，肌红蛋白、脂质含量较低，糖原含量较高，含Ⅱb型肌纤维较多的肌肉纹理粗糙、肉色浅淡，嫩度、风味欠佳，并且在应激状况下容易形成白肌肉（PSE肉）。肌纤维类型不但受其固有发育规律的调节，也会受神经内分泌、营养状况和应激等因素的影响。肌纤维类型转化伴随着动物的整个发育期。出生前肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MyHC）异构体一般以胚胎期→胎儿期→初生期→成熟期（慢Ⅰ型和快Ⅱ型）顺序表达，而成熟期的MyHC异构体则按Ⅰ→Ⅱa→Ⅱx→Ⅱb顺序相互转化［4］。巴马香猪是我国著名的地方品种猪，具有皮薄骨细、肉质鲜美、性成熟早等特点，但其生长速度慢、瘦肉率低；而长白猪是优良的外来品种，生长速度快、瘦肉率高，但肉质较差［5］。因此，上述2品种猪是比较研究猪生产性能和肉品质差异的理想模型。笔者前期研究表明，巴马香猪的肌内脂肪含量及脂肪合成相关基因表达水平均高于长白猪，且受饲粮营养水平的调控［6］。因此，本研究通过探讨饲粮能氮水平对不同品种猪的肉质性状以及肌纤维类型和细胞因子相关基因表达的影响，旨在为猪肉品质调控提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验分别选取5周龄长白猪和巴马香猪共96头（48头/品种，均为断奶阉公猪），单栏饲养，随机分为4组（每组24头猪），分别为长白猪饲喂中国猪饲养标准（GB）饲粮组、长白猪饲喂NRC饲粮组、巴马香猪饲喂GB饲粮组和巴马香猪饲喂NRC饲粮组。参照NRC（2012）猪营养需要［7］和中国《猪饲养标准》（2004）［8］配制本试验饲粮，试验饲粮组成及营养水平见表1。预试期7 d，对试验猪进行打耳标、驱虫和防疫。试验期间自由采食和饮水，每天记录采食量，观察猪只精神状况和健康情况。试验至达到出栏体重时结束。

表1 试验饲粮组成及营养水平（风干基础）Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets（air-dry basis） %

续表1

1.2 样品采集

根据 2品种猪不同的生长发育规律［9-10］，分别于3个不同的体重阶段末（长白猪：20、50和90 kg，巴马香猪：15、35和50 kg），每个组选择8头体重相近的猪只，按国家标准《生猪屠宰操作规程》屠宰取样。采集右半胴体第10～11肋骨处背最长肌样品现场测定肉品质；采集右半胴体背最长肌和股二头肌各2 g，液氮速冻后-80℃保存，用于分子生物学检测。

1.3 肉质性状测定

取第10～11肋骨处的背最长肌样品，采用专用pH计（pH Star，Germany）测定宰后45～60 min内的pH45min和宰后24 h的pH24h；采用CR410型色差计（Konica Minolta Sensing，Inc.，Tokyo，Japan）测定宰后 2 h内的肉色［亮度（L∗）、红度（a∗）、黄度（b∗）］；宰后 2～3 h，顺肌纤维方向切取2 cm×5 cm×3 cm的肉样，采用悬挂法测定滴水损失；宰后2 h内取肉样约100 g，采用蒸煮法测定熟肉率［11］。

1.4 肌纤维类型相关基因及肌细胞因子基因表达测定

参照文献［12］提取肌肉总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳法检测 RNA完整性，采用 Nanodrop 2000分光光度计（Nano-drop Technologies，Wilmington，DE）测定总RNA浓度及其在吸光度（OD）260和280 nm处的吸光值（其比值为1.9～2.0）。所有样品的RNA浓度用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水调至1 000 ng/μL左右后，按照反转录试剂盒（TaKaRa biotechnology Co.，Ltd，大连）说明书将RNA反转录为cDNA。

以合成的cDNA为模板采用实时荧光定量PCR方法测定相关基因（表2）的表达水平。引物使用Primer premier 5.0软件设计，由上海生物工程技术有限公司合成。PCR反应体系为包括5 μL cDNA模板，上、下游引物各0.5 μL。PCR反应条件为：95℃预热10 s；然后95℃ 10 s，54.7℃（根据具体引物设定）30 s，72℃ 15 s，45个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参，对获得的信号、数据进行处理，根据公式 2-ΔCt＝2-（Ct目的基因-CtGAPDH）计算目的基因的相对表达水平，其中ΔCt为目的基因Ct值与GAPDHCt值之差；Ct目的基因为目的基因的Ct值；CtGAPDH为GAPDH的Ct值。

表2 RT-PCR引物序列Table 2 Primers used for RT-PCR

1.5 数据统计分析

以品种、饲粮和生长阶段为主效应，用 SAS 9.1（SAS Institute Inc.，Cary，NC）的GLM程序对试验数据进行多因子方差分析，均值进行Tukey’s多重比较。结果以Mean和SEM表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 肉质性状

由表3可知，生长阶段、品种和饲粮均可影响肉品质。长白猪和巴马香猪的 pH45min、pH24h和滴水损失随生长阶段而显著降低（P＜0.05），肌肉肉色b∗值和熟肉率随生长阶段而显著增加（P＜0.05）。长白猪各阶段背最长肌的pH和滴水损失均显著高于巴马香猪（P＜0.05），肌肉肉色a∗值和熟肉率均显著低于巴马香猪（P＜0.05）。与NRC饲粮相比，GB饲粮可显著提高生长期长白猪和巴马香猪的pH45min（P＜0.05）。

2.2 肌纤维类型相关基因表达

由表4可知，生长阶段影响了试验猪肌纤维亚型的基因表达。随着猪的生长，骨骼肌中MyHCⅡx和MyHCⅡbmRNA表达水平上调，肥育期MyHCⅡx和MyHCⅡbmRNA表达水平高于保育和生长期。巴马香猪背最长肌中的MyHCⅠ和MyHCⅡx及股二头肌中的MyHCⅠ和MyHCⅡamRNA表达水平显著高于长白猪（P＜0.05），而股二头肌中的MyHCⅡbmRNA表达水平显著低于长白猪（P＜0.05）。品种和生长阶段对背最长肌和股二头肌中的MyHCⅡa表达水平存在显著互作效应（P＜0.05）。与NRC饲粮相比，GB饲粮可显著上调保育期和肥育期背最长肌中MyHCⅠmRNA表达水平（P＜0.05），而显著下调生长期MyHCⅠmRNA表达水平（P＜0.05）。

2.3 肌肉组织细胞因子基因表达

由表5可知，随着猪的生长，背最长肌中白细胞介素-15（IL-15）mRNA表达水平逐渐上调。股二头肌中IL-15 mRNA表达水平存在品种和生长阶段的互作效应（P＜0.05），即长白猪的mRNA表达水平随生长阶段而上调，而巴马香猪的先下调后上调。巴马香猪股二头肌中趋化素（Chemerin）mRNA表达水平显著高于长白猪（P＜0.05）。与GB饲粮相比，NRC饲粮显著上调肥育期股二头肌ChemerinmRNA表达水平（P＜0.05）。

表4 饲粮能氮水平对不同品种猪肌纤维类型相关基因mRNA表达水平的影响Table 4 Effects of dietary energy and nitrogen levels on mRNA expression level of genes related with muscle fiber types in different strains of pigs

表5 饲粮能氮水平对不同品种猪骨骼肌细胞因子mRNA表达水平的影响Table 5 Effects of dietary energy and nitrogen levels on mRNA expression level of cytokines in skeletal muscles of different strains of pigs

续表5

3 讨 论

评价肉品质的主要指标包括pH、肉色、滴水损失和熟肉率等［13］。本试验中，在相同生长阶段，巴马香猪的滴水损失低于长白猪，而肌肉肉色a∗值和熟肉率高于长白猪，这与前人报道［1，14］类似，即我国地方品种猪肉质性状优于外来品种猪。宰后机体的生理代谢终止，肌纤维中贮存的糖原发生无氧酵解产生乳酸，导致pH下降，进一步影响肉色、系水力、可溶性蛋白质浓度和货架期长短等，因而pH是评定肉质的一项重要指标。本试验中，GB饲粮可提高生长猪背最长肌pH45min，提示其有利于肉品质的改善。

由于不同类型的肌纤维特异性地表达各自特殊类型的MyHC，而不同的MyHC均有其相应的基因编码，因此通过检测MyHC基因的表达水平，可以对该肌肉进行肌纤维分型。肌纤维的类型在生长过程中不断发生转化，并受营养和非营养等因素的影响。大量研究表明，肌纤维类型是决定肉品质的一个重要因素［15］，MyHCⅠ、MyHCⅡa和MyHCⅡxmRNA的表达水平量与肌肉颜色、pH、大理石纹和肌内脂肪含量呈正相关；而MyHCⅡbmRNA的表达水平则与肉质性状呈负相关［16］。本试验中，试验猪的背最长肌和股二头肌中的MyHCⅡb和MyHCⅡxmRNA表达水平随着生长而上调，这不利于优良肉品质的形成［16］。 Wu等［17］研究发现，MyHCⅡb和MyHCⅡx型肌纤维比例随生长而增加，且与滴水损失呈显著正相关，与pH的下降呈极显著正相关。本试验表明，不同品种猪之间肌纤维类型组成比例差异明显，巴马香猪骨骼肌中MyHCⅠ和MyHCⅡa型肌纤维较多，即氧化型肌纤维较长白猪多，这可能是巴马香猪的肌肉肉色a∗值较高的一个关键原因；而长白猪骨骼肌中Ⅱb型肌纤维较多，提示巴马香猪的肉品质优于长白猪。杨晓静等［18］也有类似报道，即大白猪和二花脸猪背最长肌肌纤维类型的差异主要表现在90日龄以后，二花脸猪背最长肌较高比例的MyHCⅠ型和MyHCⅡa型肌纤维与其优良的肉质相关。本试验还发现，GB饲粮可上调保育期和肥育期的MyHCⅠmRNA表达水平，而NRC饲粮则上调生长期MyHCⅠmRNA表达水平，说明在代谢旺盛的生长期高营养水平饲粮有利于优良肉品质的形成。

骨骼肌分泌的IL-15能调控多种细胞的增殖与分化，并以内分泌和旁分泌的方式调节肌肉和脂肪组织代谢［19］。Quinn［20］研究发现，IL-15能刺激体外培养的已分化的肌细胞收缩蛋白的表达，从而促进肌纤维在体内的生长；IL-15还能刺激小鼠骨骼肌成肌细胞的分化，增加人骨骼肌肌球蛋白的表达。Li等［21］采用共培养技术，证实了IL-15参与调控猪肌肉与脂肪组织的“对话”。IL-15还可抑制骨骼肌蛋白质的降解，通过直接作用于脂肪细胞来降低动物体内的脂肪沉积［22］。本试验中，骨骼肌中的IL-15 mRNA表达水平随生长呈上调趋势，提示肌纤维分化和肌肉生长随生长而增强。脂肪细胞分泌的脂肪细胞因子Chemerin可通过自分泌途径作用于自身受体趋化因子受体-1（CMKLRl），促进脂肪细胞分化及葡萄糖转运，从而影响糖代谢和脂肪代谢［23］。研究表明，Chemerin基因与动物的眼肌面积、系水力和大理石花纹评分等肉质性状密切相关［24］，且对肌内脂肪沉积发挥重要作用［25］。本试验中，巴马香猪股二头肌中ChemerinmRNA表达水平显著高于长白猪，提示巴马香猪比长白猪具有更强的脂肪代谢和沉积能力，从而形成更多的肌内脂肪和更好的肉品质。

4 结 论

品种和生长阶段均可显著影响猪的肉质性状及相关基因的表达，饲粮能氮水平主要与生长阶段对肉质性状产生互作效应。巴马香猪具有更多的氧化型肌纤维，肉质较好；GB饲粮可上调肥育期背最长肌中MyHCⅠmRNA表达水平，从而改善猪肉品质；生长期提高饲粮能氮水平有利于优良肉品质的形成。

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Effects of Dietary Energy and Nitrogen Levels on Meat Traits and Its Related Gene Expression in Different Strains of Pigs

LIU Yingying1，2，3LI Fengna1，4LI Yinghui1，3YIN Yulong1KONG Xiangfeng1∗
（1.Key Laboratory of Agro-Ecological Processes in Subtropical Region，Hunan Provincial Engineering Research Center of Healthy Livestock，Scientific Observing and Experimental Station of Animal Nutrition and Feed Science in South-Central，Ministry of Agriculture，Institute of Subtropical Agriculture，Chinese Academy of Sciences，Changsha410125，China；2.Hunan Institute of Animal and Veterinary Sciences，Changsha410131，China；3.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing100049，China；4.Hunan Co-Innovation Center of Animal Production Safety，Changsha410128，China）

This study was conducted to investigate the effects of dietary energy and nitrogen levels on meat traits，muscle fiber type and cytokine related gene expression of pigs.Forty-eight pure-bred Bama mini-pigs and forty-eight Landrace pigs were selected and randomly allocated to four groups：Landrace pigs were fed NRC diet，Landrace pigs were fed Chinese feeding standard of swine（GB）diet，Bama mini-pigs were fed NRC diet and Bama mini-pigs were fed GB diet.The animals were fed from 5 weeks of age to their market weights.At the end of each stage（nursery，growing and finishing stages），eight pigs with similar body condition from each group were slaughted，and analysis the muscle samples.The results showed that the growth stages significantly affect the cooking yield percentage and mRNA expression levels of myosin heavy chain（My-HC）Ⅱx，MyHCⅡband interleukin-15（IL-15）oflongissimus dorsimuscle（LDM）（P＜0.05），and it shows a increasing trend with growth stage.The cooking yield percentage，mRNA expression levels ofMyHCⅠ of LDM of Bama mini-pigs were significantly higher than those of Landrace pigs（P＜0.05），while the drip loss of LDM was significantly lower（P＜0.05）.Compared with the NRC diet，the GB diet significantly increased the pH45minof LDM during growing stage（P＜0.05），and significantly up-regulated mRNA expression level ofMyHCⅠof LDM at nursery and finishing stages（P＜0.05）；compared with the GB diet，the NRC diet significantly up-regulated mRNA expression level ofMyHCⅠof LDM at growing stage（P＜0.05）.Collectively，these findings suggest that strain and growth stage have significant effects on meat traits and its related gene expression levels of pigs.Dietary energy and nitrogen levels mainly through interacted with growth stage to affect meat quality and gene expression of muscle fiber type.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2017，29（2）：547-555］

meat traits；muscle fiber type；cytokine；Bama mini-pigs；dietary energy and nitrogen levels

S828

A

1006-267X（2017）02-0547-09

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.02.022

（责任编辑 武海龙）

2016-08-01

国家973课题（2012CB124704，2013CB127305）；湖南省自然科学基金项目（S2014J504I）

刘莹莹（1982—），女，湖南邵阳人，助理研究员，博士，主要从事肉品质营养调控研究。E-mail：hunaulyy_2006＠126.com

∗通信作者：孔祥峰，研究员，博士生导师，E-mail：nnkxf＠isa.ac.cn

∗Corresponding author，professor，E-mail：nnkxf＠isa.ac.cn