口蹄疫病毒抗原表位和抗原位点的研究进展

吴磊，王建科，党江平，焦良奎

（三门峡市动物疫病预防控制中心，河南三门峡472000）

口蹄疫病毒抗原表位和抗原位点的研究进展

吴磊，王建科，党江平，焦良奎

（三门峡市动物疫病预防控制中心，河南三门峡472000）

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病。侵染对象是猪、牛、羊等主要畜种及其他家养和野生偶蹄动物。FMDV归类为小RNA病毒科（picornaviridae），口蹄疫病毒属（aphthovirus）。FMDV基因组为单股正链RNA，基因组的中部是一大的开放阅读框（open reading fragment,ORF），编码一多聚蛋白；多聚蛋白的裂解过程是由三种蛋白酶：Lpro、2A和3C来完成的,多聚蛋白经3级裂解后，形成3～4种病毒结构蛋白（VP0或VP4、VP2，VP3，VP1）和8～9种非结构蛋白（Lab,Lb,2A,2B, 2C,3A,3B,3C和3D）。

免疫细胞通常难以借助其表面受体识别整个蛋白质抗原分子，而仅识别抗原肽分子上的一个特定部分即表位（Epitope），又称为抗原决定簇（Antigenic determinant）。因而表位代表了抗原分子上的一个免疫活性区，负责与抗体分子或免疫细胞表面的抗原受体结合，严格说来，抗体的特异性是针对表位而不是针对完整的抗原分子的。

口蹄疫的四种结构蛋白构成了病毒的抗原位点，其抗原位点是指FMDV颗粒表面由几个表位或抗原决定簇组成的一个区域，其中一个表位的改变可影响该区域内相邻表位与相应单克隆抗体的反应。抗原位点（antigen site）是决定抗原性在空间上相互独立不重叠的蛋白结构小区或结构域，一个抗原位点上往往包含了多个相互关联的抗原表位。抗原位点分析是口蹄疫病毒研究领域中的一个热点。

根据与抗原受体细胞结合不同，抗原表位分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位，B细胞表位可以是构象表位也可以是线性表位，位于抗原分子表面，没有MHC（主要组织相容性复合体）限制性，不需要APC（抗原递呈细胞）处理，但是B细胞对TD抗原的识别需要巨噬细胞和Th细胞参加；T细胞表位是线性表位，无构象依赖性，蛋白质分子变性处理不会影响T细胞表位，位于抗原分子任意部位，并且有MHC限制性，需要APC处理。

1 口蹄疫病毒结构蛋白的抗原表位和位点的研究进展

对于口蹄疫病毒抗原表位的研究已有很多年历史，主要是针对口蹄疫病毒结构蛋白抗原表位的研究，其中对衣壳蛋白VP1的研究居多，VP1是主要的免疫原性抗原，包括该病毒的抗原表位。已经证实VP1在实验和自然宿主中都能诱导中和抗体的产生，RGD（arginine-glycine-aspartic acid）基序是口蹄疫病毒的VP1蛋白上高度保守的氨基酸序列，1989年，Fox利用合成肽技术指出145-147位的氨基酸序列RGD和来自VP1的203-213位残基的C-末端的氨基酸是FMDV对BHK细胞的细胞吸附位点。1990年，Baxt等也利用合成肽技术研究发现口蹄疫病毒VP1的RGD基序在病毒与细胞受体位点的相互作用中起重要作用。在VP1的顶尖处高度保守的RGD三肽可以和整联蛋白结合，并有助于口蹄疫病毒内陷进靶细胞。VP1的G-H环是已经确定的特异细胞受体的配体，并且有助于中和抗体的诱导，对C型FMDV（C-S8c1菌株）进行研究，VP1的免疫显性的G-H环，是细胞吸附的假定位点，主要的非连续性抗原表位（D表位）包括衣壳上互相邻近的VP1，VP2和VP3的残基，该表位位于病毒粒子立体构型的三重轴附近。2007年，Storey的研究表明，与βG-βH环RGD基序不同，口蹄疫SATI型病毒田间分离株Namibia（NAM/307/ 98）的VP1上的第二个RGD序列不能发挥BHK-21细胞中受体结合的配位子的作用。

口蹄疫病毒含有高度保守RGD的VP1已被鉴定是引起中和抗体产生的主要B细胞表位。1979年，Bachrach等用CNBr处理口蹄疫Al2株病毒VP1蛋白得到一个13kD大小的片段（55-179位氨基酸），用胰蛋白酶处理得到一个大小为16 kD的片段（1-144位氨基酸），实验证实二者均具有免疫原性，能诱导免疫保护。口蹄疫病毒A12亚型的VP1上有三个主要的抗原表位和一个次要表位，另外，还有一个表位在VP1和VP3上。1982年，Strohmaier等用不同种类的肽链内断酶和化学试剂CNBr切割口蹄疫O1K病毒株纯化的VP1蛋白，经过实验检测，从而确定了其上具有免疫原性的氨基酸片段在138-154位和200-213位。Krebs和Baxt等进一步研究发现，口蹄疫O型病毒的VP1变异主要发生在140-160位和200-211位两段抗原表位区，这两个肽段是决定免疫原性的抗原决定簇，随后逐步发现了结构蛋白VP2、VP3上的线性表位。

VP1的41-209位氨基酸是T细胞表位。2001年，Freiberg研究发现口蹄疫AsiaⅠ型病毒的VP1的1-20氨基酸组成的肽有抗原性但是不能诱导中和抗体的产生。Zamorano指出口蹄疫O1型病毒Campos的VP1序列（135-160位氨基酸残基）不仅含有G-H环和B细胞表位，也包含免疫显性T细胞表位，Wong HT证明VP1的141-160位氨基酸残基含有至少一种T细胞表位。为了区分病毒全蛋白序列上的口蹄疫病毒特异性T细胞表位，利用覆盖病毒全序列的442段十五肽进行淋巴细胞实验，实验证明，位于结构蛋白VP1的66-80位氨基酸残基的肽段有淋巴细胞增殖反应和IFN-γ产生，是一个牛的A31血清型MHC特异性T细胞表位。

VP1携带诱导对口蹄疫病毒免疫反应的主要的抗原位点，其中两个主要的B细胞抗原位点（141-160位氨基酸残基和200-213位氨基酸残基）诱导中和抗体的产生，另外VP1上有一个T细胞抗原位点包括21-40位氨基酸残基。早在1982年，Bittlel和Pfaffca等利用免疫原性多肽首次确定了位于口蹄疫病毒结构蛋白VP1第140-160位氨基酸之间的G—H环内含有一个免疫原性位点，称之为siteA，是口蹄疫病毒最主要的抗原位点。

结构蛋白VP4可以与MHC分子结合，VP4的20-35位存在T细胞表位。VP4的N-末端有一个T细胞位点。最近Gerner的研究表明，位于口蹄疫病毒VP4蛋白的表位可以被由DQA等位基因22021和DQB等位基因1301编码的MHCⅡDQ分子递呈，并且提出了这个特殊DQ分子的结合基序的首要证据。利用15肽和接种的杂种猪的外周血单细胞（PBMC）分析了口蹄疫病毒衣壳蛋白的病毒多肽VP4的T细胞表位。VP4的16-35残基之间的免疫显性区域被鉴定，其中20-34位残基（VP4-0）和21-35位残基（VP4-5）尤其对来自所有接种猪的PBMC呈现免疫刺激性。VP4的20-35位残基区域是广泛宿主的，免疫显性的和异型T细胞抗原位点，该位点能为串联排列的B细胞表位提供帮助。杂交动物中，MHC多态性影响合成肽的反应,VP4的20-34位残基，至少被四个不同的MHC单倍体相关联的识别，而且所有引起体外淋巴细胞增殖反应的肽段可以诱导TH1型反应，与涉及的MHC单倍体无关。口蹄疫病毒结构蛋白VP2,VP3和VP4上至少有10个未知的T细胞表位，特别是VP4的17-36氨基酸，VP2的113-132氨基酸和179-198氨基酸，VP3的129-148氨基酸在细胞转移实验中有效行使了Th细胞的功能。VP2的49-68位氨基酸，VP3的81-100位氨基酸和VP4的20-40位氨基酸包含的序列与T细胞表位的定位是一致的，VP2的54-72位氨基酸残基是被FMDVO1K株识别的T细胞位点。兰州兽医研究所的周建华等运用同源模建得到口蹄疫OA/ 58株病毒VP2蛋白的三维空间结构，并找出该蛋白的B细胞抗原表位，表明该蛋白存在多个潜在的抗原表位，可能的蛋白质抗原表位区域是：1-23，40-63，71-78，82-91，102-106，113-119，131-138，148-154，166-177，189-196，212-218。

另外，在抗原位点的研究中单克隆抗体技术起了很重要的作用。1987年，谢庆阁等筛选了30多株单抗突变株确定了口蹄疫O型病毒至少有5个中和抗原位点。根据单抗和变种的结合以及中和方式，Butchaiah G等利用7个针对AsiaⅠ型的单抗筛选口蹄疫病毒的中和抑制突变株，确定了口蹄疫AsiaⅠ型病毒存在4个抗原位点；Mateu等实验证实口蹄疫C型病毒主要有4个抗原位点；Thomas等实验表明口蹄疫A10亚型病毒有2个主要位点和2个次要位点,两个主要抗原位点中一个包含VP1的140-160序列，是胰酶敏感的，另一个主要位点是包括VP3上的部分残基,非胰酶敏感性的；两个次要位点分别位于接近VP1的169位和VP1的C末端；Baxt等实验表明，A12亚型有1个主要位点和1个次要位点,位点1是一个免疫优势抗原位点，由VP1的三个表位和VP3上的第四个表位构成。位点2包含一个单一的表位，仅位于VP1上；Saiz等针对口蹄疫A5亚型病毒Spain-86株的五株中和单克隆抗体获得一系列的中和抑制的突变株，体外和体内实验证明变异株利用选择性单克隆抗体完全可以抗拒中和作用。在交互中和实验和结合实验的基础上，两个中和性抗原位点被定位于病毒表面：一个位于VP1的C末端附近，显示为一个线性表位，第二个位于VP2，显示为两个构象表位。亲本和变异株的衣壳蛋白编码区P1的RNA核苷酸测序表明VP1的198位有第一个位点的氨基酸变化，VP2的72位和79位在第二个位点有相关表位的变化。口蹄疫C型（分离的C-S8c1）病毒的三维结构被以3.5 å分辨率结晶学判定，病毒粒子的主要椅式构象跟口蹄疫O 1型病毒的构象很像。VP1的免疫显性的G-H环，通过基因和肽图谱的方法抗原位点被鉴定位于衣壳上。一个非连续性的抗原位点（D位点）位于三重轴附近，并包含衣壳上互相邻近的VP1，VP2和VP3的残基。

2 口蹄疫病毒非结构蛋白抗原表位的研究进展

口蹄疫病毒非结构蛋白大多与病毒的复制和装配有关，T细胞表位的鉴定和特点对于理解细胞免疫介导的保护是很重要的，很多口蹄疫病毒非结构蛋白上的T细胞表位已经被鉴定。不同非结构蛋白中，多肽3A，3B和3C在体外实验中给出最高的刺激性。一部分这些抗原肽的序列在不同的口蹄疫病毒血清型中是高度保守的。他们诱导主要组织相容性复合物的产生。口蹄疫病毒3A蛋白与致病力和宿主范围有关。3A的T细胞表位有诱导Th细胞活性的能力，并可以允许B细胞引起的抗口蹄疫病毒抗体的协同诱导，3A的21-35位存在T细胞表位。P3Dpol是口蹄疫病毒主要的交叉反应的免疫决定簇，引起异型T细胞反应。

上海交通大学的孙涛等采用基因分段克隆、表达结合蛋白质印迹筛选到了口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC上高结合力、保守的感染相关线性表位，分别位于3ABC蛋白上第106-155位和156-190位氨基酸，但仍不能确定起关键作用的氨基酸。这两个表位可与感染口蹄疫不同血清型病毒动物的康复血清反应，但不与来自健康免疫动物和未接触病毒动物的血清发生反应。实验表明，用基因工程表达的多肽筛选抗原表位的方法是可行的。利用筛选噬菌体随机肽库（phage display random peptide library）方法，华中农业大学的何玉龙等从噬菌体随机十二肽库中筛选能与FMDV-NSP 3ABC抗体特异性结合的抗原模拟表位，得到提示，含有LSXPS或LAFPX或LXFSP及LSFPS（X代表V、N、Y等氨基酸）的短肽可能在猪O型FMDV-NSP 3ABC抗原表位中起作用，第2位的S、第3位的F、第5位的S中的任意两个氨基酸残基与第1位的L位和第4位的P可能构成模拟表位的骨架结构。

口蹄疫病毒非结构蛋白3D抗体的检测作为口蹄疫病毒感染的间接指示，已经被用于血清流行病学的补充方法。为了发展一个检测口蹄疫病毒抗体的敏感的cELISA方法，口蹄疫病毒-3D蛋白的免疫显性表位通过肽矩阵分析被鉴定。牛3D的16-30位氨基酸是抗体结合表位。此种方法在新的诊断方法的发展中提供了特异性抗体产生的有用工具。

以获得口蹄疫病毒3D蛋白T细胞识别的信息为目的，García-Briones利用实验中感染了口蹄疫病毒的杂种猪的淋巴细胞和90个跨越整个3D序列的重叠肽进行了体外增殖实验。2～3个肽的库的应用允许可以被来自5个被分析动物中的至少4个的淋巴细胞高效识别的T细胞表位的识别。这个识别是异型的，因为抗肽段的反应加强了携带来自不同血清型的一株口蹄疫病毒分离株的动物的再感染。根据单株肽段得到的结果证明了根据抗原库观察到的抗原性。通过3D肽段体外刺激产生的淋巴细胞进行RT-PCR的细胞因子mRNAs的缺失揭示了IFN-γ mRNAs是最持续被诱导的。这也说明激活的T细胞属于Th1亚群。这些结果表明，3D蛋白包括能被来自不同感染动物的猪T淋巴细胞高效识别的表位，都依靠初次和二次（异型的）的口蹄疫病毒感染。

为了区别口蹄疫病毒非结构蛋白3D上的特殊的T细胞表位，Gerner利用实验中感染了口蹄疫病毒的两株近亲系小型猪（c/c和d/d单倍型）的淋巴细胞对十五肽进行了增殖实验和IFN-γELISPOT实验。c/c猪的淋巴细胞从3D的三个不同区域识别该多肽，d/d猪的淋巴细胞从两个区域识别，其中一个靠近c/c猪的表位，由346-370位氨基酸残基组成。d/d淋巴细胞对代表结构蛋白VP4的肽的反应显示了另一个新的T细胞表位，反应的淋巴细胞表型的研究显示CD4（+）CD8（+）MHCⅡ细胞，经鉴定为活化的T-helper细胞。这是首次报道用近亲系猪白细胞抗原（SLA）识别口蹄疫病毒特殊的T细胞表位。

目前对于口蹄疫病毒结构蛋白和非结构蛋白抗原表位和抗原位点的研究，不仅扩展了该病毒表位的表位谱系和更加清楚了解口蹄疫病毒抗原的结构，而且对于新型疫苗的研究，如亚单位疫苗，合成肽疫苗等的发展都有十分重要的意义。□