孟鲁司特联合沙美特罗替卡松对支气管哮喘患者Th17细胞相关细胞因子表达的影响

冯秀丽+丁昌俊

[摘要]目的 觀察口服孟鲁司特联合沙美特罗替卡松吸入治疗对支气管哮喘患者体内辅助性T（Th）17细胞相关细胞因子转化生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素（IL）-17和IL-23表达的影响。方法 将2014年10月～2016年4月在本院住院及门诊就诊诊断为支气管哮喘的60例患者按照不同的治疗方法分为常规治疗组20例和孟鲁司特联合沙美特罗替卡松组40例，同时纳入健康对照组20例。分别于入院或门诊就诊治疗后3个月采用ELISA法检测所有患者空腹血清及痰培养上清中Th17细胞相关细胞因子TGF-β、IL-17和IL-23表达的变化。结果 与健康对照组比较，哮喘患者血清及痰培养上清中TGF-β、IL-17和IL-23表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。治疗后3个月，两组患者TGF-β、IL-23表达水平较治疗前显著降低（P<0.05）；与常规治疗组比较，孟鲁司特联合沙美特罗替卡松组血清TGF-β、IL-23表达水平下降更为显著（P<0.05）。两组患者血清和痰培养上清中IL-17表达水平治疗前后无显著改变（P>0.05）。结论 Th17细胞相关细胞因子参与哮喘的发病；孟鲁司特联合沙美特罗替卡松治疗可显著降低支气管哮喘患者Th17细胞相关细胞因子的表达。

[关键词]支气管哮喘；Th17细胞相关细胞因子；孟鲁司特；沙美特罗替卡松

[中图分类号] R562.2+5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）11（c）-0027-04

[Abstract]Objective To observe effect of oral Montelukast combined with Salmeterol Fluticasone inhalation on experssion levels of cytokines related to T helper （Th） 17 cells transforming growth factor beta （TGF- beta），interleukin （IL）-17 and IL-23 in patients with new-onset bronchial asthma.Methods According to different treatment methods， sixty patient with new-onset bronchial asthma admitted into our hospital from October 2014 to April 2016 were divided into routine treatment group（n=20） and Montelukast combined with Salmeterol Fluticasone group whom received Montelukast combined with Salmeterol Fluticasone （n=40）.Another 20 health people were selected as healthy group.The serum and sputum supernatan levels of inflammatory factors such as TGF-β，IL-17 and IL-23 were measured by ELISA before and after outpatient treatment for 3 months.Results Compared with healthy group，the serum and sputum supernatan levels of inflammatory factors such as TGF-β，IL-17 and IL-23 was higher that in the routine treatment group and the Montelukast combined with Salmeterol Fluticasone group，and the difference was statistically significant （P<0.01）.After treatment for 3 months，the expression level TGF-β and IL-23 of two groups was significantly lower than that before treatment （P<0.05）；compared with routine treatment group，expression levels of serum TGF-β and IL-23 in the Montelukast combined with Salmeterol Fluticasone group decreased significantly （P<0.05）.There was no significant change in the expression of IL-17 in the serum and sputum supernatant of two groups before and after treatment for 3 months （P>0.05）.Conclusion Cytokines related cytokines Th17 cells may play important roles in the development of asthma，and using of Montelukast combined with Salmeterol Fluticasone can inhibit the experssion of cytokines related to Th17 in patients with asthma.

[Key words]Bronchial asthma；Cytokines related to Th17 cells；Montelukast；Salmeterol Fluticasone

支气管哮喘（简称哮喘）是由多种细胞（如嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、呼吸道上皮细胞等）和细胞组分参与的呼吸道慢性炎症性和呼吸道高反应性为特征疾患，因治疗不足导致死亡率居高不下。据统计全世界目前大约有3亿哮喘患者，我国约有3000万哮喘患者并逐年增加。最新儿童哮喘国际共识指出，尽管目前使用激素、β受体激动剂等现有有效方法治疗，全球仍有50%的儿童哮喘得不到控制[1]。过去一直用“Th1/Th2失衡学说”来解释哮喘的发病机制[2]，但是越来越多的证据表明，Th1/Th2平衡的调节并不单纯受Th1和Th2自身的影响。Th17细胞是近年来发现的一种新的CD4+辅助性T细胞亚群，其产生的细胞因子白细胞介素（IL）-17、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和IL-23在慢性炎癥性疾病和自身免疫性疾病的发生发展中发挥了重要作用。本研究进一步探讨Th17细胞相关细胞因子在哮喘患者中的表达水平及孟鲁司特联合沙美特罗替卡松治疗后的表达变化。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2014年10月～2016年4月在我院呼吸科门诊和住院新近确诊的60例支气管哮喘患者为研究对象。入选标准：①年龄18～65岁，无性别限制；②根据GINA（2009版）明确诊断为支气管哮喘，且发病时间<1年，FEV1%≥60%的轻中度持续哮喘患者；③未使用吸入性糖皮质激素治疗；④知情同意后参加研究。排除标准：凡有下列情况之一者，不作为入选病例。①既往有吸烟史；②肝功能、肾功能、心功能不全患者，或合并其他脏器严重疾病；③排除其他肺部疾病（如COPD、支气管及肺部肿瘤）。其中男39例，女21例；年龄（47.91±4.32）岁。将60例患者按照不同的治疗方法分为常规治疗组20例和孟鲁司特联合沙美特罗替卡松组40例，两组患者年龄、性别、病情等资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

同时纳入20例我院健康体检人群作为健康对照组，其中男13例，女7例；年龄（45.23±3.77）岁，排除标准：①患有慢性肺部疾病、过敏性疾病人群；②具有哮喘家族史者；③1个月内无急性上呼吸道感染和或肺部感染病史；④无糖皮质激素及免疫抑制剂应用史。

1.2方法

1.2.1给药方法 常规治疗组给予常规对症支持治疗，即进行吸氧、吸痰、抗感染、静脉输液等综合治疗。口服孟鲁司特（鲁南贝特制药有限公司，国药准字H20083372）联合沙美特罗替卡松（Glaxo Operations UK Limited，批准文号：H20140165）组在常规治疗的基础上加用沙美特罗替卡松（舒利迭）每次50/250 μg，bid，联合口服孟鲁司特10 mg，qd，并进行为期3个月的随访。分别收集治疗前及规范治疗3个月后两组患者诱导痰及外周血血清。

1.2.2诱导痰及血清的收集 所有研究对象均采用等渗盐水冲洗口腔，后吸入沙丁胺醇200 μg，3.0%高渗盐水10 ml超声雾化吸入进行痰诱导。在诱导过程中受试者如出现严重呼吸困难、咳嗽则随时停止。分别测定诱导前和诱导期间FEV1%。收集痰标本后以4倍痰液体积的1%二硫苏糖醇对痰进行处理，2000 r/min离心10 min，收集上清液保存于-20℃。收集清晨空腹肘静脉血清，静置20 min后3000 r/min离心15 min，收集血清保存于-20℃。

1.2.3 Th17细胞相关细胞因子TGF-β、IL-17和IL-23检测 应用北京美迪科生物技术有限公司提供的放射免疫试剂盒，采用酶联免疫吸附法测定诱导痰及空腹血清中TGF-β、IL-17和IL-23水平，具体操作过程按试剂盒说明书进行。

1.3统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料用百分率（%）表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1治疗前后两组患者血清Th17细胞相关细胞因子表达水平的变化

治疗前，两组哮喘患者血清TGF-β、IL-17和IL-23表达显著高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。治疗后3个月，两组患者血清TGF-β、IL-23表达较治疗前显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；其中口服孟鲁司特联合沙美特罗替卡松组下降更明显，与常规治疗组比较差异有统计学意义（P<0.05）。两组治疗后IL-17表达水平无明显变化（P>0.05）（表1）。

2.2治疗前后患者诱导痰上清液中Th17细胞相关细胞因子表达水平的变化

口服孟鲁司特联合沙美特罗替卡松组治疗前，新发哮喘患者痰培养上清中TGF-β、IL-17和IL-23表达显著高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。治疗后3个月，常规治疗组和孟鲁司特联合沙美特罗替卡松组患者痰培养上清液中TGF-β、IL-23表达较治疗前显著降低，其中孟鲁司特联合沙美特罗氟替卡松组下降更加显著，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗前后两组IL-17表达水平均无明显变化（P>0.05）（表2）。

3讨论

哮喘是一种慢性气道变应性疾病，CD4+T细胞的过度活化在哮喘的发病过程中起着关键的枢纽作用。过去一直用“Th1/Th2失衡学说”来解释哮喘的发病机制[3]，但是越来越多的证据表明，Th1/Th2平衡的调节并不单纯受Th1和Th2自身的影响。在临床上，也没有足够的证据证明用Th1细胞因子可以有效地治疗哮喘。相关文献报道即使用大量抗原特异性Th1细胞干预并不能使Th2细胞诱导的气道高反应性得到控制[3-4]。Th17细胞是近来发现的不同于Thl和Th2的另一种CD4+T细胞亚群，其相关的细胞因子主要包括TGF-β、IL-17和IL-23。TGF-β可诱导CD4+初始T细胞向Th17细胞分化，从而促进炎症反应。研究证实TGF-β缺乏小鼠体内Th17细胞比例显著降低[5-7]；同时研究发现TGF-β可直接促进气道间质细胞及上皮细胞中细胞外基质蛋白ECM表达，促进气道平滑肌中纤维蛋白沉积致气道壁增厚进而促进气道重构[8-9]。IL-17是由Th17细胞分泌的一种最主要炎症细胞因子，其参与哮喘发病主要通过募集气道嗜酸粒细胞聚集浸润于气道局部，促进气道高反应性的产生[10-11]。IL-23在维持Th17细胞稳定以及诱导其增殖方面发挥关键作用。研究显示IL-23缺乏可减少气道局部嗜酸粒细胞浸润和Th2细胞因子的产生，从而改善气道炎症预防哮喘发生[12]。

本研究通过观察新发支气管哮喘经孟鲁司特联合沙美特罗氟替卡吸入治疗3个月后Th17相关细胞因子变化，进一步探讨Th17细胞相关因子在哮喘发病过程中的作用及抗炎治疗对其的影响。本研究结果显示，与健康对照组比较，哮喘患者血清及痰培养上清中TGF-β、IL-17和IL-23表达显著升高，差异有统计学意义，这与蒋鲲等[13]的研究结果一致。这提示Th17细胞及相关细胞因子分泌是参与哮喘发病的重要机制。经孟鲁司特联合沙美特罗替卡松治疗后，患者血清和痰培养上清中TGF-β、IL-23表达较治疗前显著降低，且显著低于常规治疗组，可见早期给予孟鲁司特联合沙美特罗替卡松治疗对气道重塑干预效果显著，这为临床早期孟鲁司特联合沙美特罗替卡松治疗哮喘提供了进一步的实验依据。血清和痰培养上清液中IL-17表达水平在治疗前后均无显著变化，这与笔者预期的研究结果不一致，考虑IL-17在哮喘发病中作用復杂[14]。研究报道IL-17在炎症发生发展过程中具有双向调节作用，IL-17在过敏性哮喘的建立过程中起正性调节作用[15-16]。在哮喘的致敏过程中IL-17又具有抑制炎症反应的作用，因此针对IL-17在哮喘发病中的具体作用机制，尚需进一步更基础的实验研究来证实。本研究样本量较少，且观察时间较短，并未进行长期随访，因此关于Th17细胞相关因子对哮喘发病中的具体机制尚需进一步研究。

[参考文献]

[1]Cao Y，Sun Z，Liao L，et al.Human adipose tissue-derived stem cells differentiate into endothelial cells in vitro and improve postnatal neovascularization in vivo[J].Biochem Biophys Res Commun，2005，332（2）：370-379.

[2]Kim Y，Lee S，Kim YS，et al.Regulation of Th1/Th2 cells in asthma development： a mathematical model[J].Math Biosci Eng，2013，10（4）：1095-1133.

[3]Borish L，Aarons A，Rumbyrt J，et al.Interleukin-10 regulation in normal subjects and patients with asthma[J].J Allergy Clin Immunol，1996，97（6）：1288-1296.

[4]Dulek DE，Newcomb DC，Toki S，et al.STAT4 deficiency fails to induce lung Th2 or Th17 immunity following primary or secondary respiratory syncytial virus （RSV） challenge but enhances the lung RSV-specific CD8+ T cell immune response to secondary challenge[J].J Virol，2014，88（17）：9655-9672.

[5]Harrington LE，Hatton RD，Mangan PR.Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages[J].Nat Immunol，2005，6（11）：1123-1132.

[6]Durrant DM，Metzger DW.IL-12 can alleviate Th17-mediated allergic lung inflammation through induction of pulmonary IL-10 expression[J].Mucosal Immunol，2010，3（3）：301-311.

[7]G？觟kmen MR，Dong R，Kanhere A，et al.Genome-wide regulatory analysis reveals that T-bet controls Th17 lineage differentiation through direct suppression of IRF4[J].J Immunol，2013，191（12）：5925-5932.

[8]Moir LM，Burgess JK，Black JL.Transforming growth factor beta 1 increases fibronectin deposition through integrin receptor alpha 5 beta 1 on human airway smooth muscle[J].J Allergy Clin Immunol，2008，121（4）：1034-1039.

[9]Secker GA，Shortt AJ，Sampson E，et al.TGF beta stimulated re-epithelialisation is regulated by CTGF and Ras/MEK/ERK signaling[J].Exp Cell Res，2008，314（1）：131-142.

[10]Wakashin H，Hirose K，Maezawa Y，et al.IL-23 and Th17 cells enhance Th2-cell-mediated eosinophilic airway inflammation in mice[J].Am J Respir Criti Care Medicine，2008，178（10）：1023-1032.

[11]Moraes-Vieira PM，Larocca RA，Bassi EJ，et al.Leptin deficiency impairs maturation of dendritic cells and enhances induction of regulatory T and Th17 cells[J].Eur J Immunol，2014，44（3）：794-806.

[12]Hackett TL，Warner SM，Stefanowicz D，et al.Induction of epithelial-mesenchymal transition in primary airway epithelial cells from patients with asthma by transforming growth factor-beta1[J].Am J Respir Crit Care Med，2009， 180（2）：122-133.

[13]蒋鲲，陈和斌，王莹，等.IL-17和TGF-β1在支气管哮喘患儿血清及支气管肺泡灌洗液中的变化及临床意义[J].中国当代儿科杂志，2013，15（8）：604-608.

[14]覃毅华.支气管哮喘急性发作期患者白细胞介素（IL-17）及超敏C反应蛋白的水平变化及临床意义[J].中国现代医生，2014，52（18）：23-25.

[15]Durrant DM，Gaffen SL，Riesenfeld EP，et al.Development of allergen-induced airway inflammation in the absence of T-bet regulation is dependent on IL-17[J].J Immunol，2009，183（8）：5293-5300.

[16]Lendermon EA，Dodd-o JM，Coon TA，et al.CD8（+）IL-17（+）T cells mediate neutrophilic airway obliteration in T-bet-deficient mouse lung allograft recipients[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2015，52（5）：622-633.

（收稿日期：2016-10-17 本文編辑：方菊花）