猪瘟免疫疫苗的研究与应用

赵 晓，胡仕凤，张建超，彭禄庭，吴宗耀，张子易，韩奇鹏

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.湖南省浏阳市畜牧兽医水产局，湖南长沙410300；3.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙410128）

猪瘟免疫疫苗的研究与应用

赵 晓1，2，胡仕凤1※，张建超2，彭禄庭2，吴宗耀2，张子易2，韩奇鹏3

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.湖南省浏阳市畜牧兽医水产局，湖南长沙410300；3.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙410128）

猪瘟病毒一直威胁着养猪业健康发展。文章主要从猪瘟疫苗的新情况、抗体消长规律与免疫程序制定、猪瘟检测方法的研究与应用等方面进行阐述，为进一步研究猪瘟疫苗免疫防控提供理论参考。

猪瘟疫苗；免疫；疫苗研究

世界范围内重要猪病之一的猪瘟(classical swine fever，CSF)是一种发热、急性和接触性动物传染病，主要由黄病毒科(family flaviviridae)瘟病毒属(genuspestivirus)猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高热稽留、高病死率和出血等主要特征，会导致实质器官坏死、梗死和慢性纤维素性坏死性肠炎变化。不容易被诊断和确诊的猪瘟是由低致病力毒株引起的，而高致病力毒株比较容易发现，因为引起的病死率较高。猪瘟是一种能造成养猪业严重经济损失的传染病，可引起猪群原发性病原感染和免疫抑制，进而导致猪群继发或混合感染其他疾病。猪瘟属于全世界流行性猪病，对全世界养猪业健康发展构成很大的威胁。我国为防控猪瘟的发生，采取的措施是强制免疫，如接种疫苗等有效防控大范围发生猪瘟的情况。但在局部地区还是会发生猪瘟，可能是动物及其产品流动无序或防控措施单一等原因导致的。

1 猪瘟疫苗的新情况

控制猪瘟流行的里程碑是成功研制了猪瘟弱毒疫苗。猪瘟弱病毒疫苗在免疫防御中使用后，有效防止猪瘟的发生、传播及降低经济损失[1]。猪瘟弱病毒疫苗能够激发动物机体产生免疫应答反应，所以猪瘟弱病毒疫苗的免疫保护效果良好，且能够抵抗猪瘟病原的感染及保护免疫动物机体不受猪瘟疫病的影响。因此，猪瘟弱病毒疫苗广泛成为防控猪瘟流行及清除猪瘟等的重要手段。

全球生物安全一直是关注热点问题。猪瘟弱病毒疫苗无论是连续传代感染还是大剂量接种，都不会出现毒力增强、感染和向外排毒的现象，今儿证明猪瘟弱病毒疫苗对生物安全没有威胁。但是，由于不正确的免疫程序也许会导致接种猪瘟弱病毒疫苗的猪只感染猪瘟[2]。

随着全球贸易的发展，成为制约猪瘟免疫防控的主要元素之一。因为现在技术无法区分常规疫苗免疫接种感染和自然感染猪瘟抗体，所以进口生猪及其肉质品通不过猪瘟检疫，影响国家生猪及其肉质品进出口贸易。所以，一些国家不采取免疫接种猪瘟疫苗进行猪瘟防控，而是一旦发生就采取大面积捕杀的办法，进而造成巨大的经济损失[3]。

近年来，基因工程应用到猪瘟疫苗防控领域。E2亚单位疫苗-基因工程亚单位标记疫苗应运而生。为检测E2亚单位疫苗在不激发动物机体产生抗体的情况下，对亚单位疫苗免疫和自然感染进行区分，进而更新升级了配套的诊断技术[4]。但E2亚单位疫苗发挥免疫保护需要的时间间隔较长，不能进行紧急接种防控猪瘟疫情的扩散[5]。

目前，除上述两种猪瘟疫苗外，还有细胞源猪瘟活疫苗、传代细胞源ST猪瘟活疫苗和兔源脾淋源猪瘟活疫苗。还有实际生产中猪瘟、猪丹毒二联活疫苗，猪瘟、猪多杀性巴氏杆菌、猪丹毒三联活疫苗，呼吸综合征、猪瘟二联活疫苗，猪瘟耐热保护剂活疫苗和高致病性猪繁殖二联活疫苗等[6]。此外，为补充传统CSF兔化弱病毒一面不足和满足根除CSF的要求。各国专家、学者研制出新型CSF疫苗，但同样存在一些缺陷。上述亚单位疫苗属于新型疫苗，想要有效保护猪只，需要多次免疫和配合佐剂来实现，研制成本较高。核酸疫苗潜在存在整合和转化染色体的危险，且诱导生产抗体的速度较慢，接种剂量较大。病毒活体载体疫苗，由于无法完全了解病毒自然发生和变异的机制，所以不能控制病毒活体载体疫苗的未来走向，存在安全隐患较大。还有基因缺失弱病毒疫苗是人工删除毒力基因片段，不可以自行修复，虽然没有返祖现象发生，但长期使用对CSFV原有病毒群落和生态环境造成改变，进而致使CSF流行病株的演化方向发生偏离。

综上所述，现在没有一种猪瘟疫苗可以完全控制和净化CSF。但随着科学技术的不断发展进步及分子生物学的完善，将来会生产出更有效、廉价、安全的CSF疫苗，来有效防控和净化CSF。

2 抗体消长规律与免疫程序制定

2.1 猪瘟疫苗抗体消长规律

影响猪场免疫效果的因素很多，如猪群的营养水平和健康状况、疫苗的种类与品质、接种的时间与剂量等。所以，想要保证猪瘟防疫效果，需要检测抗体维持时间和母源抗体的消长规律，再根据猪群健康水平和疾病流行情况科学、合理的制定和改进免疫程序[7]。有研究显示，特异性较好的正向间接血凝法(IHA法)和酶联免疫吸附法(ELISA法)两种检测方法，可以实时跟踪检测仔猪出生后猪瘟母源抗体水平，对猪瘟母原抗体消长规律进行系统分析，找到仔猪初免得最佳时间(25～32d)[8]。但由于研究背景不同，得出的初免日龄是不同的(33或37)[9]，虽然采用的都是ELISA检测猪瘟抗体水平，进而分析出猪瘟抗体消长的规律。2016年姚俊庸采用ELISA抗体检测方法对三个不同的猪场的母猪猪瘟抗体和新生仔猪猪瘟母原抗体进行检测分析抗体消长的规律。结果显示，不同猪场母猪自身的猪瘟抗体不同，母源抗体对仔猪保护持续时间是不同的，会呈现正相关。确定首免时间，再根据科学的监测跟踪，制定科学、合理的二免日期，可有效保护仔猪受到猪瘟病毒的威胁[10]。

此外，ELISA试剂盒与中和抗体的相关性来制定的免疫方案，不但可以检测分析猪瘟母源抗体消长规律，而且可以有效分析出O型口蹄疫和猪高致病性蓝耳病猪母源抗体的消长规律[11]。还有用IDEXX试剂盒进行实验，首免选择被免疫后第7周，有30%的哺乳仔猪被保护(抗体阳性率30%)，再3周后二免，免疫效果很好[12]。

综上所述，不同猪场、群体、猪自身营养水平和身体健康状况等，对猪母源抗体消长规律产生不同程度的影响，致使仔猪初免时间和二免时间没有特定的规律可循，所以要做好事实监测程序，随时根据外在、内在因素等变化进行相应的免疫时间调整。

2.2 猪瘟合理免疫程序的制定

母猪在一般是产后25天左右开始注射猪瘟疫苗，种公猪一般是每年春秋两季，静脉注射1次猪瘟疫苗。被猪瘟免疫的母猪乳汁中存在母源抗体，可通过乳汁进入仔猪体内，给仔猪提供免疫保护。仔猪出生3日龄时对猪瘟免疫能力较强，母源抗体中和效价为 1：64～1：128，20 日龄仔猪体内母源抗体中和效价降低到1：32，保护率为75%。仔猪出生1个月后，随着母源抗体中和效价的降低到1：16，母源抗体的免疫能力不能给仔猪提供保护。因此，仔猪首免一般是在25～30日龄左右二免是在65日龄左右。但对于猪瘟高发区的猪场及养殖户，可在上述基础上进行一次超前免疫[13]。上述只是举了一个免疫程序通列，仅供参考。

3 猪瘟检测方法

猪瘟是《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》作为我国重点防范和优先防治的16种动物疫病之一。控制猪瘟重要手段是防控和免疫，难题是检测和免疫评估，尤其是选择检测试剂盒及其检测结果的分析。

酶联免疫吸附试验(ELISA)是世界动物卫生组织推荐的猪瘟检测方法之一[14]。ELISA检测方法有操作简单、便捷和结果易辨别等优点。所以，ELISA检测方法是国际认可、应用最广，可大规模注射的猪瘟抗体血清学检测方法。

猪瘟ELISA抗体试剂盒商品化后，根据原理不同分为两种类型。间接ELISA原理：试剂盒检测的反应孔颜色与结合在反应板中的特异性抗体量呈现正相关；液相阻断ELISA原理：试剂盒检测的反应孔颜色与血清中的抗体含量呈负相关[15]。

3.1 间接ELISA原理检测方法

间接ELISA原理检测方法的检测敏感度较高，因为其主要针对包被抗原蛋白的多克隆抗体。

CSFV的E0、E2和NS3单个基因可诱导生产猪瘟抗体，诱导机体生成保护性抗体的是E0基因和E2基因，不具有病毒中和活性的是NS3基因[16]。高度保守的NS3，具有RNA解旋酶、核苷三磷酸酶和丝氨酸蛋白酶活性。作为病毒复制、增殖必需蛋白的NS3，制作出的重组蛋白的ELISA检测试剂盒可应用于非全病毒的猪只免疫接种新疫苗，有效区分新型猪瘟疫苗激发机体产生的抗体和全病毒(野毒和疫苗毒)。

猪瘟病毒E0基因工程疫苗发展很快，随之配套建立的免疫猪的血清学诊断方法，可应用于鉴别诊断新型疫苗和野毒感染(猪瘟弱病毒)。有研究显示，毕赤酵母表达CSFV E0蛋白建立的ELISA检测方法，检测24份试验动物血清后，得出可对自然感染猪和疫苗免疫猪进行正确区分的结论。

E2蛋白诱导机体内产生高滴度的中和抗体，是CSFV保护性抗原的主要之一。因此，采用建立好的CSFV血清抗体间接ELISA检测方法对临床的E2蛋白多个抗原表位进行检测，得出较IDEXXCSFV ELISA抗体试剂盒检测的E2蛋白单一抗原表位更为理想的检测结果，为CSFV血清抗体间接ELISA试剂盒的广泛应用提供理论基础[17]。由于E2蛋白有位于其N端氨基酸残基第690～866位的A、B、C、D四个抗原区[18]。全长E2的目的基因的蛋白表达量占菌体蛋白含量的10%左右，而优化的E2蛋白目的基因片段，蛋白表达含量可占菌体蛋白含量的50%左右。简言之，目的蛋白表达量受重组载体的外源基因长度影响。CSFV E2蛋白可通过大肠埃希菌表达，通过间接ELISA方法进行血清样本检测，加上间接血凝试验，特异性可达96.7，灵敏性可达97.5%[19]。CSFV E2还可通过PK-15细胞进行表达，加上间接ELISA可进行大量血清样本检测，此法不能区分BVDV、BDV、CSFV抗体，但显著提高了灵敏性[20]。重组的CSFV E2蛋白进行表达，通过建立CSFV IgM抗体的间接ELISA进行300份临床血清样本检测，并于Idexx ELISA抗体检测试剂盒进行结果对比分析，结果符合率达到80.3%[21]。

3.2 液相阻断ELISA原理检测方法

液相阻断ELISA原理检测方法的特异性较高，采用单克隆抗体检测，但实际检测对象是单一表位抗体。如果表位抗体浓度不高，会降低检测的敏感性。现在，猪瘟疫苗抗体检测方法有很多，美国Idexx公司生产的猪瘟疫苗抗体阻断ELISA检测试剂盒应用最为广泛，猪瘟疫苗阳性抗体阻断率达到40%以上，但实际应用过程中，猪瘟疫苗抗体阻断ELISA检测试剂盒阻断率达到50%以上(猪瘟疫苗抗体相当于中和抗体滴度1：32，才对猪群具有保护作用[22],并以此作为生产实际中猪瘟疫苗抗体合格标准。有研究表明，猪瘟疫苗抗体阻断ELISA检测方法可对猪瘟疫苗抗体进行有效检测，为降低猪瘟病毒感染的风险，猪瘟免疫程序的及时优化，提供数据依据[23]。液相阻断-酶联免疫吸附检测方法，检测猪瘟抗体平均合格率达到96.0%[24]。

3.3 荧光定量PCR检测方法

猪瘟弱病毒疫苗1950年在我国研制出来，为猪瘟控制做出一定的贡献。猪瘟在我国一直存在，原因很多。由于朱文病毒新变异，导致疫苗免疫失败。母猪隐性带毒、温和型、非典型化等猪瘟症状普遍存在。因此，猪瘟防控策略层出不穷，虽然猪瘟免疫疫苗覆盖率和应用程度得到有效提高，但由于猪瘟与蓝耳病剖检和临床症状相似，进而加大今年来对猪瘟临床诊断大的难度[25]。猪瘟实验室有多种诊断手段，RT-PCR技术是常用猪瘟诊断方法之一[26]。实际生产中的RT-PCR技术对猪瘟流行毒株和疫苗毒株区分不开，且操作较为繁琐、成本较高、灵敏度较低、漏诊等缺点[27]。但RT-nPCR检测方法，可以通过特异性条带大小，对猪瘟毒性强弱做出判断[28]。有研究显示，依据CSFV基因区域序列不同建立的RT-PCR检测方法，则检测的效果也大不相同。如依据CSFV基因高保守区域序列建立RT-PCR检测方法，较更快的区分CSFV[29]。国际GB/T16551-2008规定的套式RT-PCR检测方法，灵敏性较常规RT-PCR高1000倍[30]。还有根据E2基因建立的套式RT-PCR方法，可以高灵敏和高特异性的检测出CSFV cDNA最低极限量1×10-7g/L。此外，套式PCR较夹心ELISA、荧光抗体法等检测方法，除检测速度快、灵敏性高等特点外，可在样品保存不理想的条件下进行快速、高效检测[31]。为解决套式RT-PCR检测方法的不足，有学者设计了复合套式RT-PCR方法，可最小检出CSFV的量是10-1TCID50[32]。此法以CSFV高保守区域基因NS5B为靶基因，建立反转录-复合套式PCR检测方法，通过结果分析，得出反转录-复合套式PCR检测方法具有特异性高、灵敏性好，可通过电泳图像直观区分流行毒株和疫苗毒株，为生产实践提供有效检测CSFV的方法[33]。

4 结论

现阶段猪瘟防控主要手段是疫苗免疫接种，其中影响猪瘟疫苗免疫效果的重要环节是科学免疫程序的制定。每个猪场的免疫程序都存在不同程度的差异[34]。所以猪瘟疫苗抗体监测是猪场防疫主要方法，依据疫苗抗体消长情况，对疫苗接种方案做出及时优化调整，进而提高免疫的效果。由于猪场生产过程较为复杂，饲养管理、猪舍设计、日常调群等对疫苗免疫效果都存在影响。因此，革新免疫接种技术，树立群体免疫意识，进而提高疫苗免疫效果，降低猪场经济损失，提高生产效益。

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S851

A

1006-4907（2017）04-0040-04

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.04.020

2017-07-04

赵晓（1990～），女，汉族，湖南浏阳人，硕士，主要从事动物疫病防控，E-mail：740620086qq.com。

※通讯作者：胡仕凤（1970～），女，汉族，博士，副教授，研究方向：畜禽疫病防控，E-mail：445065268@qq.com。